作者IFN113 (CY)
看板Biotech
标题[求救] HEK293T IFA 问题及改善方法
时间Thu Mar 21 18:07:13 2019
(手机排版)
呜呜呜呜呜呜呜呜
先感谢点进来的大大们
小妹压力爆棚快往生了
老板一直觉得为啥核比较大颗 (??)
为什麽没办法染出mitochondira 均匀分布在细胞的样子，老板说要看到均匀分布的美图呀QQ
本lab目前没有存在做过的人，小妹我也是自己摸索试看看，无人能讨论故求板上大神们解救一下呜呜
以下为小妹做的方式
免疫萤光染色
1. 种细胞
取2.5 ×105 cell/well transfected 好的HEK293T cell 种於24mm圆玻片上培养16小时，去除上清液，wash PBS 2次，加入混有200nM Mitotracker的medium 培养40分钟
2. 固定细胞
以medium 混好的3.7% Paraformaldehyde 固定细胞 15 min 後wash PBS 两次
3. 细胞打洞
配置pernibilization buffer : 0.25% Triton X-100 加入Well内5 min
4. Blocking
配置blocking buffer 1% BSA，以最低rpm於常温摇晃1小时，
再用PBS buffer wash 3次
5. 加入1o Ab (1:250) 作用O/N 隔天用PBS wash 2次
6. 加入2o Ab Goat anti-rabbit 488 (1:250)
以最低rpm摇1小时，再用PBS wash 2次
7. 取出玻片滴上含有DAPI封片胶後盖於载玻片上周围涂上指甲油固定封片
然後使用Confocal (ZEISS LSM700) 拍的
我有乖乖做Z-stack QAQ...
每次做到加triton时细胞都给我飘起来说hello..
(改0.1%也是)
我已经非常非常非常小心的加任何试剂了QQ…
我要怎麽做出细胞贴的好好，然後mitochondira均匀分布的美图咧QAQ
大大们可以帮小妹做个检讨吗TAT
以下图档:
红色：Mitotracker
>>MitoTracker™ Red CMXRos (Thermo)
绿色：目标protein
蓝色：DAPI
http://i.imgur.com/zDygmBc.jpg
谢谢!!!!!!!!
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1F：推 tynse71864: 玻片有先抠吗 03/21 20:36
2F：推 tynse71864: 1. 293非常会飘，试试看玻片用 0.01%PLL抠一小时,他会 03/21 21:30
3F：→ tynse71864: 贴的比较好，自然不易被冲下来。 03/21 21:30
4F：→ tynse71864: 2. formaldehyde会用 PBS 之类的 bfr 稀释吧？ 渗透压 03/21 21:30
5F：→ tynse71864: 过高也会影响 fixation过剧而皱缩。 03/21 21:30
6F：推 tynse71864: 後来查了 mitotracker的建议，上述第二点就忽略吧! 可 03/21 21:41
7F：→ tynse71864: 以从第一点改善 03/21 21:41
8F：推 Ianthegood: 小弟跟动物细胞不熟, 2 formaldehyde的medium里是有fb 03/21 22:59
9F：→ Ianthegood: s的吗? 03/21 22:59
10F：推 Devilxxx: formaldehyde是拿来固定细胞的，有没有fbs好像没啥关系 03/25 20:52
11F：→ Devilxxx: ？ 03/25 20:52
12F：推 ChloeClark: 我自己的经验是，虽然mitotrcke「号称」对细胞没有毒 04/26 07:37
13F：→ ChloeClark: 性，但事实上却因细胞而异，我记得tracker也可以死染 04/26 07:38
14F：→ ChloeClark: （自己查一下），可以改成固定後跟抗体一起染，或者 04/26 07:38
15F：→ ChloeClark: 改用抗体抓粒线体，这样图会美一点，粒线体也较於呈现 04/26 07:38
16F：→ ChloeClark: 它原本的形状。另外「粒线体均匀分布在细胞中」，欸 04/26 07:38
17F：→ ChloeClark: 抖...有的细胞的粒线体是围在细胞核附近的，你要不要 04/26 07:38
18F：推 s73121: 换细胞株做，293易漂，没漂也容易在加入试剂时变圆，当然 06/14 22:08
19F：→ s73121: 细胞质区域就变少不容易观察，若非得用293,那就先用poly-l 06/14 22:08
20F：→ s73121: ysine coating试试 06/14 22:08