作者yiimingg (點點)
看板Biotech
標題[求救] ligation 測濃度 dsdna 濃度超高OAO
時間Tue Jan 22 18:56:41 2019
準備ligation之前測濃度
看的是雙股DNA那個部分，有對照組，也有放blank，對照組是15.16，表示這項測驗可相信，但！！我測出來的是
Insert : 709.35
Vector : 696.78
請問有大大有遇過超高標的mass嗎ノ( ' - 'ノ)
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1. 260/280的值是15-19之間，對照組是1.多～
2. Insert 是病毒片段，準備做chimeric virus
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※ 編輯: yiimingg (140.120.117.157), 01/22/2019 18:58:30
1F：→ turtle24: 稀釋一下跑個膠啊...01/22 19:06
2F：→ turtle24: 雖然好像應該先看一下260/280的比值01/22 19:07
3F：→ xxtomnyxx: 我猜你的 DNA 是 phenol-chroloform 萃取的吧01/22 20:59
4F：→ xxtomnyxx: phenol-chroloform 萃取的 DNA 常常沒辦法用吸光值定量01/22 21:00
5F：→ xxtomnyxx: ，不知道為什麼數值都會飆超高，用 gel extraction/PCR01/22 21:01
6F：→ xxtomnyxx: clean-up kit 純化的就不會有這個問題01/22 21:01
7F：推 Ianthegood: 跑膠定量吧01/22 22:44
8F：→ yiimingg: 是病毒和載體XD 準備做chimeric virus，關於跑膠定量我01/23 00:52
9F：→ yiimingg: 是病毒和載體XD 準備做chimeric virus，關於跑膠定量我01/23 00:52
10F：→ yiimingg: 明天會再查資料嘗試看看，感謝大大們( ‧ 蹏s‧? )01/23 00:52
※ 編輯: yiimingg (114.46.128.202), 01/23/2019 00:55:16
11F：→ turtle24: DNA測 260/280一般只會小於1.8 , 15-19一定殘留很多東西 01/23 09:50
12F：→ yiimingg: 我是分別digestion 的，用Ecor1 和Bgl2 一個是2.1 buff 01/23 11:04
13F：→ yiimingg: er，另外一個是 3.1 buffer，digestion 後都有跑膠看大 01/23 11:04
14F：→ yiimingg: 小，都坐落在合理的位置，做了一學期都搞不出來QQ 請問 01/23 11:04
15F：→ yiimingg: digestion 後還有什麼方式可以確認大小嗎？ 01/23 11:04
16F：→ Ianthegood: 切膠怎麼做的 純化後有跑膠嗎 01/24 00:38
17F：→ yiimingg: 我是分別digestion 2次，第一次O/N 後沒有跑膠，直接用 01/24 12:41
18F：→ yiimingg: EB 洗出來，第二次digestion 後才跑膠的 01/24 12:41
19F：→ blence: 有濃度了,你切多少ug,elute多少ul,算一下就可以知道的答案 01/24 19:57
20F：→ blence: 你們上頭的leader怎麼放任這樣的實驗拖了一學期阿 01/24 19:59
21F：→ Ianthegood: 分別切兩次？為何？ 01/24 22:17
22F：→ Ianthegood: 然後EB是什麼? 01/24 22:18
23F：→ Ianthegood: 你怎麼純化的？一開始就問了好像都沒回答 01/24 23:28
24F：→ Ianthegood: 然後濃度怎麼測的 spec還是nanodrop 01/24 23:28
25F：→ yiimingg: 但考慮到發文求救所digestion 出來的產物不可用，我就 01/25 11:33
26F：→ yiimingg: 再digestion 一次，昨天得出來的值是Insert : 260/280: 01/25 11:33
27F：→ yiimingg: 1.37, 4.8ng/ulVector : 260/280: 1.81, 67.94ng/ul 01/25 11:33
28F：→ yiimingg: 我就分別用 1:3 和1:7 的比例去ligation 01/25 11:33
29F：→ yiimingg: EB 就是elute buffer 01/25 11:33
30F：→ yiimingg: 是因為所使用的酵素buffer 分別是 Buffer 2.1 和 Buffe 01/25 11:35
31F：→ yiimingg: r 3.1，所以分兩次切 01/25 11:35
32F：→ yiimingg: 至於上頭為何放任，我想這是實驗室第一次做 chimeric v 01/25 11:37
33F：→ yiimingg: irus，所以上頭也放手讓我自己嘗試找答案OAO 01/25 11:37
34F：→ yiimingg: 請問妳是說什麼程序後的純化ㄋ？ 01/25 11:40
35F：→ a90648: 這是實驗室第一次做virus相關的plasmid嗎? 01/25 15:01
36F：→ yiimingg: 請問這和我求救的點有相關性嗎？QQ 01/25 16:01
37F：→ a90648: 因為virus相關的plasmid不能用一般的competent cell 01/25 18:20
38F：→ a90648: 卡了一個學期應該不只是ligation這邊有問題 01/25 18:26
39F：→ a90648: 應該也有挑不到對的菌，甚至菌根本沒有長這幾個狀況 01/25 18:27
40F：→ Ianthegood: 單從cloning角度來看，能夠double digest就絕對不要 01/25 20:04
41F：→ Ianthegood: 分開做，只要多一個步驟就是會掉產量。再加上你中間過 01/25 20:04
42F：→ Ianthegood: column(我猜的，你也沒講)跟後面切膠(也是猜的，你沒 01/25 20:04
43F：→ Ianthegood: 講)都是回收很容易很慘的地方。要提高產量無他，增加 01/25 20:04
44F：→ Ianthegood: 反應物的量，減少步驟。nanodrop(我猜的，你沒講)讀 01/25 20:04
45F：→ Ianthegood: 值10ng/ul以下基本上跟noise分不出來，我可以跟你說你 01/25 20:04
46F：→ Ianthegood: insert裡面大概都是水。 01/25 20:04
47F：→ Ianthegood: 再來一點elution buffer(哪個牌子的什麼kit都不講)這 01/25 20:11
48F：→ Ianthegood: 種東西通常是Tris EDTA，意思是你的第二支RE如果需要2 01/25 20:11
49F：→ Ianthegood: + cation，你那個rxn就等於白跑了 01/25 20:11
50F：→ yiimingg: 原來芽～ 我是用DH5a！我的內容是要連續接4種insert 進 01/26 09:07
51F：→ yiimingg: 去一個 vector裡面，前面的2種insert 學姐都是用DH5a， 01/26 09:07
52F：→ yiimingg: 換我接手，是要接進去第3種insert～ 01/26 09:07
53F：→ yiimingg: 我得到的insert 和 vector 都有被定序過 01/26 09:09
54F：→ yiimingg: 一個是buffer 2.1 一個是buffer 3.1，所以我才分開dige 01/26 09:11
55F：→ yiimingg: stion，請問，是否有方法可以一起digestion 嗎？（尋求 01/26 09:11
56F：→ yiimingg: 更好的解決方案 01/26 09:11
57F：→ yiimingg: 第一次digestion 後沒有跑膠，單純用kit 洗出來，就因 01/26 09:14
58F：→ yiimingg: 為怕回收率太低 01/26 09:14
59F：推 tynse71864: 第一次回收完只要 clean up 就好；同樓上幾位， nanod 01/26 10:15
60F：→ tynse71864: rop在這情況下的值我覺得都高估很多，建議跑膠或估算 01/26 10:15
61F：→ tynse71864: 都比較準 01/26 10:15
62F：→ yiimingg: 第一次digestion 後，我就只是clean up 然後elute 出來 01/26 12:31
63F：→ yiimingg: ，第二次才跑膠 01/26 12:31
64F：→ Ice9: 我懷念以前的 Buffer，Buffer 3 可供 EcoRI/BglII 共切。 01/28 01:17
66F：→ Ianthegood: 3.1還是可以一起切 01/28 06:16
67F：→ Ianthegood: 個人偏好可以用ethanol precipitation就不要過column/ 01/28 06:18
68F：→ Ianthegood: beads 回收率一定比較低 01/28 06:18
69F：→ Ianthegood: 為什麼會實驗室沒人帶做cloning 連double digest都沒 01/28 06:20
70F：→ Ianthegood: 教 01/28 06:20
71F：→ xxtomnyxx: NEBuffer N 和 N.1 我記得只差在 N.1 通通加了 BSA 01/28 17:32
72F：→ osla30: 要接多insert，可試試Gibson Assembly 01/28 21:56
73F：→ Ianthegood: 連RE都沒人帶了你要他試gibson 樓上別鬧了 01/29 07:08
74F：→ osla30: RE現在不都同一種buffer了，我都用Thermo的FastDigest系列 01/29 08:51
75F：→ osla30: NEB的話HF系列也都配Cutsmart buffet，但HF較貴，Thermo便 01/29 08:54
76F：→ osla30: 宜多了 01/29 08:54
77F：→ osla30: Gibson與傳統方法相較下，效率高多了，insert不需切，vect 01/29 08:59
78F：→ osla30: or可用切的或PCR成線性化 01/29 08:59
79F：→ turtle24: 個人不會建議實驗卡一個學期的學生從換廠牌下手 01/30 12:49
80F：→ turtle24: 再卡一個學期的機會比做出來還大… 01/30 12:50
81F：→ yiimingg: 我看到您推薦的網址惹！結果我就是用NEB家的酵素，但是 01/30 16:00
82F：→ yiimingg: 我會分開切是因為之前有去對比過Ecor1 用buffer 2.1的 01/30 16:00
83F：→ yiimingg: 酵素活性100* 但是用buffer 3.1只有50～ 但這次再做不 01/30 16:00
84F：→ yiimingg: 出的話，一起切也是個好方法^^ 01/30 16:00
85F：→ yiimingg: 也不是沒人教，老師有教過跑整套cPCR 現在又換了不一樣 01/30 16:04
86F：→ yiimingg: 的DNA，不一樣的product，條件我還是要自己抓啊…… 01/30 16:04
87F：→ Ianthegood: 兩隻一起切 切20ug+ o/n 然後全部切膠純化 這是過去10 01/31 08:58
88F：→ Ianthegood: 年都在做cloning的人給的意見 聽不聽隨你 反正不是我 01/31 08:59
89F：→ Ianthegood: 要畢業 01/31 08:59
90F：→ yiimingg: 謝謝 :) 01/31 12:24
91F：推 machin: 中間沒細看，推分開切。有仔細研究過buffer的效率就知 02/26 19:15