作者yiimingg (点点)
看板Biotech
标题[求救] ligation 测浓度 dsdna 浓度超高OAO
时间Tue Jan 22 18:56:41 2019
准备ligation之前测浓度
看的是双股DNA那个部分，有对照组，也有放blank，对照组是15.16，表示这项测验可相信，但！！我测出来的是
Insert : 709.35
Vector : 696.78
请问有大大有遇过超高标的mass吗ノ( ' - 'ノ)
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1. 260/280的值是15-19之间，对照组是1.多～
2. Insert 是病毒片段，准备做chimeric virus
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※ 编辑: yiimingg (140.120.117.157), 01/22/2019 18:57:45
※ 编辑: yiimingg (140.120.117.157), 01/22/2019 18:58:16
※ 编辑: yiimingg (140.120.117.157), 01/22/2019 18:58:30
1F：→ turtle24: 稀释一下跑个胶啊...01/22 19:06
2F：→ turtle24: 虽然好像应该先看一下260/280的比值01/22 19:07
3F：→ xxtomnyxx: 我猜你的 DNA 是 phenol-chroloform 萃取的吧01/22 20:59
4F：→ xxtomnyxx: phenol-chroloform 萃取的 DNA 常常没办法用吸光值定量01/22 21:00
5F：→ xxtomnyxx: ，不知道为什麽数值都会飙超高，用 gel extraction/PCR01/22 21:01
6F：→ xxtomnyxx: clean-up kit 纯化的就不会有这个问题01/22 21:01
7F：推 Ianthegood: 跑胶定量吧01/22 22:44
8F：→ yiimingg: 是病毒和载体XD 准备做chimeric virus，关於跑胶定量我01/23 00:52
9F：→ yiimingg: 是病毒和载体XD 准备做chimeric virus，关於跑胶定量我01/23 00:52
10F：→ yiimingg: 明天会再查资料尝试看看，感谢大大们( ‧ 蹏s‧? )01/23 00:52
※ 编辑: yiimingg (114.46.128.202), 01/23/2019 00:55:16
11F：→ turtle24: DNA测 260/280一般只会小於1.8 , 15-19一定残留很多东西 01/23 09:50
12F：→ yiimingg: 我是分别digestion 的，用Ecor1 和Bgl2 一个是2.1 buff 01/23 11:04
13F：→ yiimingg: er，另外一个是 3.1 buffer，digestion 後都有跑胶看大 01/23 11:04
14F：→ yiimingg: 小，都坐落在合理的位置，做了一学期都搞不出来QQ 请问 01/23 11:04
15F：→ yiimingg: digestion 後还有什麽方式可以确认大小吗？ 01/23 11:04
16F：→ Ianthegood: 切胶怎麽做的 纯化後有跑胶吗 01/24 00:38
17F：→ yiimingg: 我是分别digestion 2次，第一次O/N 後没有跑胶，直接用 01/24 12:41
18F：→ yiimingg: EB 洗出来，第二次digestion 後才跑胶的 01/24 12:41
19F：→ blence: 有浓度了,你切多少ug,elute多少ul,算一下就可以知道的答案 01/24 19:57
20F：→ blence: 你们上头的leader怎麽放任这样的实验拖了一学期阿 01/24 19:59
21F：→ Ianthegood: 分别切两次？为何？ 01/24 22:17
22F：→ Ianthegood: 然後EB是什麽? 01/24 22:18
23F：→ Ianthegood: 你怎麽纯化的？一开始就问了好像都没回答 01/24 23:28
24F：→ Ianthegood: 然後浓度怎麽测的 spec还是nanodrop 01/24 23:28
25F：→ yiimingg: 但考虑到发文求救所digestion 出来的产物不可用，我就 01/25 11:33
26F：→ yiimingg: 再digestion 一次，昨天得出来的值是Insert : 260/280: 01/25 11:33
27F：→ yiimingg: 1.37, 4.8ng/ulVector : 260/280: 1.81, 67.94ng/ul 01/25 11:33
28F：→ yiimingg: 我就分别用 1:3 和1:7 的比例去ligation 01/25 11:33
29F：→ yiimingg: EB 就是elute buffer 01/25 11:33
30F：→ yiimingg: 是因为所使用的酵素buffer 分别是 Buffer 2.1 和 Buffe 01/25 11:35
31F：→ yiimingg: r 3.1，所以分两次切 01/25 11:35
32F：→ yiimingg: 至於上头为何放任，我想这是实验室第一次做 chimeric v 01/25 11:37
33F：→ yiimingg: irus，所以上头也放手让我自己尝试找答案OAO 01/25 11:37
34F：→ yiimingg: 请问你是说什麽程序後的纯化ㄋ？ 01/25 11:40
35F：→ a90648: 这是实验室第一次做virus相关的plasmid吗? 01/25 15:01
36F：→ yiimingg: 请问这和我求救的点有相关性吗？QQ 01/25 16:01
37F：→ a90648: 因为virus相关的plasmid不能用一般的competent cell 01/25 18:20
38F：→ a90648: 卡了一个学期应该不只是ligation这边有问题 01/25 18:26
39F：→ a90648: 应该也有挑不到对的菌，甚至菌根本没有长这几个状况 01/25 18:27
40F：→ Ianthegood: 单从cloning角度来看，能够double digest就绝对不要 01/25 20:04
41F：→ Ianthegood: 分开做，只要多一个步骤就是会掉产量。再加上你中间过 01/25 20:04
42F：→ Ianthegood: column(我猜的，你也没讲)跟後面切胶(也是猜的，你没 01/25 20:04
43F：→ Ianthegood: 讲)都是回收很容易很惨的地方。要提高产量无他，增加 01/25 20:04
44F：→ Ianthegood: 反应物的量，减少步骤。nanodrop(我猜的，你没讲)读 01/25 20:04
45F：→ Ianthegood: 值10ng/ul以下基本上跟noise分不出来，我可以跟你说你 01/25 20:04
46F：→ Ianthegood: insert里面大概都是水。 01/25 20:04
47F：→ Ianthegood: 再来一点elution buffer(哪个牌子的什麽kit都不讲)这 01/25 20:11
48F：→ Ianthegood: 种东西通常是Tris EDTA，意思是你的第二支RE如果需要2 01/25 20:11
49F：→ Ianthegood: + cation，你那个rxn就等於白跑了 01/25 20:11
50F：→ yiimingg: 原来芽～ 我是用DH5a！我的内容是要连续接4种insert 进 01/26 09:07
51F：→ yiimingg: 去一个 vector里面，前面的2种insert 学姐都是用DH5a， 01/26 09:07
52F：→ yiimingg: 换我接手，是要接进去第3种insert～ 01/26 09:07
53F：→ yiimingg: 我得到的insert 和 vector 都有被定序过 01/26 09:09
54F：→ yiimingg: 一个是buffer 2.1 一个是buffer 3.1，所以我才分开dige 01/26 09:11
55F：→ yiimingg: stion，请问，是否有方法可以一起digestion 吗？（寻求 01/26 09:11
56F：→ yiimingg: 更好的解决方案 01/26 09:11
57F：→ yiimingg: 第一次digestion 後没有跑胶，单纯用kit 洗出来，就因 01/26 09:14
58F：→ yiimingg: 为怕回收率太低 01/26 09:14
59F：推 tynse71864: 第一次回收完只要 clean up 就好；同楼上几位， nanod 01/26 10:15
60F：→ tynse71864: rop在这情况下的值我觉得都高估很多，建议跑胶或估算 01/26 10:15
61F：→ tynse71864: 都比较准 01/26 10:15
62F：→ yiimingg: 第一次digestion 後，我就只是clean up 然後elute 出来 01/26 12:31
63F：→ yiimingg: ，第二次才跑胶 01/26 12:31
64F：→ Ice9: 我怀念以前的 Buffer，Buffer 3 可供 EcoRI/BglII 共切。 01/28 01:17
66F：→ Ianthegood: 3.1还是可以一起切 01/28 06:16
67F：→ Ianthegood: 个人偏好可以用ethanol precipitation就不要过column/ 01/28 06:18
68F：→ Ianthegood: beads 回收率一定比较低 01/28 06:18
69F：→ Ianthegood: 为什麽会实验室没人带做cloning 连double digest都没 01/28 06:20
70F：→ Ianthegood: 教 01/28 06:20
71F：→ xxtomnyxx: NEBuffer N 和 N.1 我记得只差在 N.1 通通加了 BSA 01/28 17:32
72F：→ osla30: 要接多insert，可试试Gibson Assembly 01/28 21:56
73F：→ Ianthegood: 连RE都没人带了你要他试gibson 楼上别闹了 01/29 07:08
74F：→ osla30: RE现在不都同一种buffer了，我都用Thermo的FastDigest系列 01/29 08:51
75F：→ osla30: NEB的话HF系列也都配Cutsmart buffet，但HF较贵，Thermo便 01/29 08:54
76F：→ osla30: 宜多了 01/29 08:54
77F：→ osla30: Gibson与传统方法相较下，效率高多了，insert不需切，vect 01/29 08:59
78F：→ osla30: or可用切的或PCR成线性化 01/29 08:59
79F：→ turtle24: 个人不会建议实验卡一个学期的学生从换厂牌下手 01/30 12:49
80F：→ turtle24: 再卡一个学期的机会比做出来还大… 01/30 12:50
81F：→ yiimingg: 我看到您推荐的网址惹！结果我就是用NEB家的酵素，但是 01/30 16:00
82F：→ yiimingg: 我会分开切是因为之前有去对比过Ecor1 用buffer 2.1的 01/30 16:00
83F：→ yiimingg: 酵素活性100* 但是用buffer 3.1只有50～ 但这次再做不 01/30 16:00
84F：→ yiimingg: 出的话，一起切也是个好方法^^ 01/30 16:00
85F：→ yiimingg: 也不是没人教，老师有教过跑整套cPCR 现在又换了不一样 01/30 16:04
86F：→ yiimingg: 的DNA，不一样的product，条件我还是要自己抓啊…… 01/30 16:04
87F：→ Ianthegood: 两只一起切 切20ug+ o/n 然後全部切胶纯化 这是过去10 01/31 08:58
88F：→ Ianthegood: 年都在做cloning的人给的意见 听不听随你 反正不是我 01/31 08:59
89F：→ Ianthegood: 要毕业 01/31 08:59
90F：→ yiimingg: 谢谢 :) 01/31 12:24
91F：推 machin: 中间没细看，推分开切。有仔细研究过buffer的效率就知 02/26 19:15