作者Faustus73 (HYC)
看板Biotech
標題[求救] E. coli S17菌株subcloning問題請教
時間Mon Jan 7 15:44:38 2019
版上前輩們好，
我是最近剛開始做cloning實驗的新手，
但因為cloning一直失敗，
盤不是長不出colony，不然就是直接長爆...
經由PCR check後也都沒有成功...
（有換過新的digestion enzyme，
也有試過在不同溫度下ligase，
以及不同的ligase時間長短)
所以打算用實驗室之前已經存好的菌株下去做subcloning，
但因為學長沒有存到DH5a的菌株，
只有存到E. coli S17的菌株，
所以想來版上請教前輩們，
請問以S17這隻菌作為宿主的話，
我還能抽它的質體繼續做subcloning的實驗嗎？
感謝指教！！！
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※ 編輯: Faustus73 (39.9.138.29), 01/07/2019 15:48:43
1F：→ turtle24: 是指學長留下的質體subclone都失敗才想從S17純化質體嗎 01/07 16:15
2F：→ turtle24: 那我會多花一點心思在確認學長的plasmid map正不正確 01/07 16:17
有噢，我是兩邊同步在進行的。原先的菌株抽完質體送定序後的結果，跟學長map中的cut site沒有產生突變，而且digestion後的跑膠結果，band的長度也和預期的差不多，但是怎麼接就是接不起來，盤總是不長colony...。剛好有找到這隻存在S17的基因序列有我實驗需要的片段，所以才考慮要從這隻菌下手，做subcloning。
3F：→ turtle24: 重新塗盤挑幾個菌落切切看酵素跟map有沒有一致 01/07 16:18
※ 編輯: Faustus73 (39.9.138.29), 01/07/2019 16:32:31
4F：推 agagy: 同上，序列跟抗性一定要對，做cloning最怕用前人的材料了 01/07 16:40
5F：→ agagy: insert有確認過的話，那vector呢？長爆的話可能是單一切點 01/07 16:45
6F：→ agagy: 所以自接？ 01/07 16:45
7F：→ turtle24: 如果有人帶著做troubleshooting會比較快知道原因 01/08 09:26
8F：→ turtle24: 沒人帶的話控制組跟紀錄本都要妥善，至少老師能幫你看 01/08 09:27
9F：推 MADAOTW: transformation後挑菌前, 用 Protoplasting assay 看到 01/13 13:34
10F：→ MADAOTW: 底是不是正常的 insert 01/13 13:34
11F：→ MADAOTW: 最好的情況是能挑20顆以上clones 作初篩 01/13 13:44
12F：→ blence: 別亂教叫人挑這麼多顆好嗎？這樣不叫troubleshooting 01/13 14:44
13F：→ xxtomnyxx: 會成功的 cloning，挑 1 顆，最多 3 顆就該挑到正確的 01/13 17:09
14F：→ xxtomnyxx: clone 了，不會成功的 cloning，你挑 100 顆，就算給你 01/13 17:09
15F：→ xxtomnyxx: 挑到了 1 顆正確的，你將來還是不會做 cloning。 01/13 17:09
16F：推 Ianthegood: 我覺得很多e coli裡面發生的事情都還未知 多挑幾顆真 01/14 04:09
17F：→ Ianthegood: 的無妨 我colony pcr一次也都一盤XD 01/14 04:09
18F：→ blence: 如果挑出的clone除了on target外容易有off target,是需要 01/14 10:51
19F：→ blence: 多挑幾顆,如果都是可預期的no target,怪菌Ecoil是無辜的 01/14 10:53
20F：→ Ianthegood: 隨手狗了一下 s17是cloning strain沒錯啊 所以B大說得 01/14 17:03
21F：→ Ianthegood: 對 Ecoli是無辜的 01/14 17:03
22F：→ turtle24: 學生挑20個菌結果我被老闆洗臉… 01/15 08:14
23F：→ turtle24: 我自己是挑6顆，定序送2顆 01/15 08:15
24F：→ turtle24: 可是學生不是我帶的… 01/15 08:16