作者Faustus73 (HYC)
看板Biotech
标题[求救] E. coli S17菌株subcloning问题请教
时间Mon Jan 7 15:44:38 2019
版上前辈们好，
我是最近刚开始做cloning实验的新手，
但因为cloning一直失败，
盘不是长不出colony，不然就是直接长爆...
经由PCR check後也都没有成功...
（有换过新的digestion enzyme，
也有试过在不同温度下ligase，
以及不同的ligase时间长短)
所以打算用实验室之前已经存好的菌株下去做subcloning，
但因为学长没有存到DH5a的菌株，
只有存到E. coli S17的菌株，
所以想来版上请教前辈们，
请问以S17这只菌作为宿主的话，
我还能抽它的质体继续做subcloning的实验吗？
感谢指教！！！
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 39.9.138.29
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※ 编辑: Faustus73 (39.9.138.29), 01/07/2019 15:48:43
1F：→ turtle24: 是指学长留下的质体subclone都失败才想从S17纯化质体吗 01/07 16:15
2F：→ turtle24: 那我会多花一点心思在确认学长的plasmid map正不正确 01/07 16:17
有噢，我是两边同步在进行的。原先的菌株抽完质体送定序後的结果，跟学长map中的cut site没有产生突变，而且digestion後的跑胶结果，band的长度也和预期的差不多，但是怎麽接就是接不起来，盘总是不长colony...。刚好有找到这只存在S17的基因序列有我实验需要的片段，所以才考虑要从这只菌下手，做subcloning。
3F：→ turtle24: 重新涂盘挑几个菌落切切看酵素跟map有没有一致 01/07 16:18
※ 编辑: Faustus73 (39.9.138.29), 01/07/2019 16:32:31
4F：推 agagy: 同上，序列跟抗性一定要对，做cloning最怕用前人的材料了 01/07 16:40
5F：→ agagy: insert有确认过的话，那vector呢？长爆的话可能是单一切点 01/07 16:45
6F：→ agagy: 所以自接？ 01/07 16:45
7F：→ turtle24: 如果有人带着做troubleshooting会比较快知道原因 01/08 09:26
8F：→ turtle24: 没人带的话控制组跟纪录本都要妥善，至少老师能帮你看 01/08 09:27
9F：推 MADAOTW: transformation後挑菌前, 用 Protoplasting assay 看到 01/13 13:34
10F：→ MADAOTW: 底是不是正常的 insert 01/13 13:34
11F：→ MADAOTW: 最好的情况是能挑20颗以上clones 作初筛 01/13 13:44
12F：→ blence: 别乱教叫人挑这麽多颗好吗？这样不叫troubleshooting 01/13 14:44
13F：→ xxtomnyxx: 会成功的 cloning，挑 1 颗，最多 3 颗就该挑到正确的 01/13 17:09
14F：→ xxtomnyxx: clone 了，不会成功的 cloning，你挑 100 颗，就算给你 01/13 17:09
15F：→ xxtomnyxx: 挑到了 1 颗正确的，你将来还是不会做 cloning。 01/13 17:09
16F：推 Ianthegood: 我觉得很多e coli里面发生的事情都还未知 多挑几颗真 01/14 04:09
17F：→ Ianthegood: 的无妨 我colony pcr一次也都一盘XD 01/14 04:09
18F：→ blence: 如果挑出的clone除了on target外容易有off target,是需要 01/14 10:51
19F：→ blence: 多挑几颗,如果都是可预期的no target,怪菌Ecoil是无辜的 01/14 10:53
20F：→ Ianthegood: 随手狗了一下 s17是cloning strain没错啊 所以B大说得 01/14 17:03
21F：→ Ianthegood: 对 Ecoli是无辜的 01/14 17:03
22F：→ turtle24: 学生挑20个菌结果我被老板洗脸… 01/15 08:14
23F：→ turtle24: 我自己是挑6颗，定序送2颗 01/15 08:15
24F：→ turtle24: 可是学生不是我带的… 01/15 08:16