作者GDCOC (大俠讓三招)
看板Biotech
標題[求救] PCR的升降溫速度
時間Fri Dec 7 11:53:15 2018
請教各位熟悉PCR機器的高手
正常的PCR機器應該要在幾秒內的誤差到達指定溫度?
我有使用外接的PROBE偵測well內的實際溫度
我的program是
94c 30s
57c 30s
66c 45s
實際測量發現從94到57的時候，
probe的溫度剛降到61度時，機器已經開始讀秒，
而當probe顯示真正降到57度時，時間已過了15秒以上了，
其他的step也是這樣，大概都要過10-15秒才能真正到達指定的溫度
請問這樣是正常的嗎
因為我做的是multiplex PCR，最近發現很容易出現non-specific band
會是因為機器溫度sensor壞了之類的關係嗎
麻煩高手幫忙解惑了 感謝
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1F：推 hitmd: 我猜應該是機器的特性，防止加熱或降溫過頭，所以接近溫度 12/07 12:34
2F：→ hitmd: 時會降低速度後逼近設定溫度，至於為何先讀秒就要請廠商問 12/07 12:34
3F：→ hitmd: 問原廠，是說是哪個廠牌的呢？ 12/07 12:34
4F：→ GDCOC: Cole-Parmer 12/07 13:12
5F：→ blence: 什麼是"幾秒內的誤差到達指定溫度",是指94到57度的時間? 12/07 14:09
6F：→ blence: 你是發現機器已經顯示到57度開始數秒,可是實際溫度才61度? 12/07 14:11
7F：→ blence: 你是認為probe跟機器同時顯示57度時只剩15秒,所以不OK嗎? 12/07 14:13
8F：→ GDCOC: 對,實際才61就開始數秒,這樣我指定30秒不就沒有意義了 12/07 16:38
9F：→ GDCOC: 真正作用在57度的時間只有15秒而已 12/07 16:39
10F：→ GDCOC: 因為沒測過其他牌子也不知道這種情況是不是正常的 12/07 16:39
11F：→ blence: 先不考慮機器有無問題，純看你的擔憂是多慮了 12/07 17:22
12F：→ blence: anneal在高溫不會亂黏，低溫才容易有non-specific band 12/07 17:22
13F：→ blence: 而且就算你認為61->57度不該讀秒,primer就不會偷跑嗎？ 12/07 17:23
14F：→ blence: 還是擔心的話，把anneal設成45秒就不怕時間不夠了 12/07 17:23
15F：→ blence: 如果是溫度顯示不準確或定溫後會明顯跳動,問題才大 12/07 17:27
16F：推 Ianthegood: 很多機器可以設ramp 不過會真的去測的你是我聽過的第 12/07 17:35
17F：→ Ianthegood: 一個 推一個 12/07 17:35
18F：推 Ianthegood: pcr大概都是peltier element 測溫跟加熱算是一起的 12/07 17:39
19F：→ Ianthegood: 所以應該沒壞 大概是設計就是這樣 那你也只能在這台 12/07 17:39
20F：→ Ianthegood: 機器的特性下去修改你的條件(buffer, program,etc) 12/07 17:39
21F：→ Ianthegood: 所以寫paper才要寫明機器的牌子XD 12/07 17:39
22F：→ xxtomnyxx: 很重要的一點，PCR 機器沒辦法直接去測sample的溫度， 12/07 18:29
23F：→ xxtomnyxx: 只能用加熱板上的seneor取得加熱板的溫度，而加熱板的 12/07 18:30
24F：→ xxtomnyxx: 的溫度並不代表sample的溫度，所以大部份機器跑PCR時才 12/07 18:31
25F：→ xxtomnyxx: 會要你設定反應體積，這是用來讓機器「估計」加熱板達 12/07 18:32
26F：→ xxtomnyxx: 到指定溫度時sample理論上要多久才會跟著達到這個溫度 12/07 18:33
27F：→ xxtomnyxx: ，直接用probe測會不準很正常，PCR溫度校正也都是校正 12/07 18:33
28F：→ xxtomnyxx: 加熱板的seneor，所以是指定一個溫度後看probe最後的終 12/07 18:34
29F：→ xxtomnyxx: 點溫度是否和設定一致，而不會去檢測加熱達到指定溫度 12/07 18:35
30F：→ xxtomnyxx: 時probe的溫度是否正確。 12/07 18:35
31F：推 jabari: 你拿三個水浴鍋作看看 12/07 21:13
32F：→ Ice9: 就算拿三個鍋做實驗，還是會有samples升降溫時間問題 XDD 12/08 05:53
33F：推 Ice9: 另推原PO的觀察實測精神。 12/08 05:55
34F：推 untilnow: 你的probe有校正過嗎 12/08 11:23
35F：推 aaaazzzz: 推樓上BIX大的解釋,也對原PO實測溫度表達敬意 12/08 14:54
36F：→ GDCOC: probe有校驗過喔,另外,我後來找了一台ABI9700來測, 12/10 11:04
37F：→ GDCOC: 他的升降溫會稍微超過1-2度,然後再拉回來 12/10 11:05
38F：→ GDCOC: 倒數計時也是差不多到指定溫度才開始計時,不會差超過2度 12/10 11:06
39F：→ GDCOC: 可能真的是機台設計不同,這樣在使用IVD產品的時候, 12/10 11:12
40F：→ GDCOC: 更改pragram內容對於實驗室認證會有困擾>< 12/10 11:13
41F：→ GDCOC: 感謝各位的解釋&建議 12/10 11:14