作者blence ( )
看板Biotech
標題Re: [求救] 細胞打散後放一陣子後嚴重成團無法解決
時間Tue Nov 20 04:44:18 2018
※ 引述《steve42125 (Shiburin)》之銘言：
: 實驗步驟是這樣的
: 以0.5ml trypsin-EDTA消化大約3min之後以1.5ml medium中和
: 離心1250rpm, 5mins後去除上清以適當比例打散
: 打散的方法是會先用200ul pipette打大概30次
: 再以1ml pipette取1ml medium再打大約20次之後依pellet大小稀釋進行細胞記數
細胞被打散，被離心，又被打散，應該很痛苦吧
當你[以1.5ml medium中和時]，
1.確認當時細胞已經一顆顆分離
2.就可以取10ul計數，剩下的細胞有需要再去離心
3.計數完算好用量，剛好離心完可以分盤安排實驗
這樣就很順利了阿
而且你的離心時間也比我的多一倍，打散的細胞也會黏得更緊密
Counting chamber的設計應該不會一團沒打散的細胞跑進去
用這個來判斷有沒有散開，比用dish直接看還不準確
已經分散開的細胞，就算手勢在怎麼搖，甚至不搖
也只會影響細胞在dish的分佈有沒有均勻
不覺得會讓細胞5~10分鐘內團塊聚集
另外，你每個步驟流程耗費時間跟熟悉度
分三個clone操作是應該的
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1F：推 steve42125: 謝謝大大額外回一篇來幫我解說！有幾個小問題想要請問 11/20 08:19
2F：→ steve42125: 想請問你離細胞的轉速跟時間通常用多久? 11/20 08:20
3F：→ steve42125: 想說降到1000 rpm, 3 mins 不知道夠不夠 11/20 08:20
我沒有提到降轉速阿
4F：→ steve42125: 第二個問題是如果數完離心在打散 不會因為離心lost掉 11/20 08:21
5F：→ steve42125: 細胞而使得細胞數不準確嗎? 11/20 08:21
如果細胞計數會明顯差異，顯然是有些細胞離心不下來
也就是不少死亡或狀況不佳的細胞，那應該去改善你的culture流程
6F：→ steve42125: 最後是你說的分三個clone是指說一次消化一個Clone 11/20 08:21
7F：→ steve42125: 全部消化好計算好之後再開始分盤做實驗? 11/20 08:22
8F：→ steve42125: 還是說一次消化一盤做好一個Clone的ABC實驗分盤 再 11/20 08:23
9F：→ steve42125: 再做下個實驗？ 不好意思問題有點多 再麻煩您的建議！ 11/20 08:23
10F：推 tynse71864: b 大應該是建議後者 三盤當三個實驗做 11/20 09:24
11F：→ tynse71864: 目前的轉速應該沒問題 11/20 09:25
嗯，沒錯是後者
從PBS wash開始到細胞放回去養，時間越短越好
※ 編輯: blence (140.109.40.29), 11/20/2018 11:35:49
12F：推 steve42125: 了解了！ 謝謝B大 我會試試看你的建議 謝謝你！ 11/20 11:58