作者blence ( )
看板Biotech
标题Re: [求救] 细胞打散後放一阵子後严重成团无法解决
时间Tue Nov 20 04:44:18 2018
※ 引述《steve42125 (Shiburin)》之铭言：
: 实验步骤是这样的
: 以0.5ml trypsin-EDTA消化大约3min之後以1.5ml medium中和
: 离心1250rpm, 5mins後去除上清以适当比例打散
: 打散的方法是会先用200ul pipette打大概30次
: 再以1ml pipette取1ml medium再打大约20次之後依pellet大小稀释进行细胞记数
细胞被打散，被离心，又被打散，应该很痛苦吧
当你[以1.5ml medium中和时]，
1.确认当时细胞已经一颗颗分离
2.就可以取10ul计数，剩下的细胞有需要再去离心
3.计数完算好用量，刚好离心完可以分盘安排实验
这样就很顺利了阿
而且你的离心时间也比我的多一倍，打散的细胞也会黏得更紧密
Counting chamber的设计应该不会一团没打散的细胞跑进去
用这个来判断有没有散开，比用dish直接看还不准确
已经分散开的细胞，就算手势在怎麽摇，甚至不摇
也只会影响细胞在dish的分布有没有均匀
不觉得会让细胞5~10分钟内团块聚集
另外，你每个步骤流程耗费时间跟熟悉度
分三个clone操作是应该的
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 180.218.151.4
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1542660260.A.AAA.html
1F：推 steve42125: 谢谢大大额外回一篇来帮我解说！有几个小问题想要请问 11/20 08:19
2F：→ steve42125: 想请问你离细胞的转速跟时间通常用多久? 11/20 08:20
3F：→ steve42125: 想说降到1000 rpm, 3 mins 不知道够不够 11/20 08:20
我没有提到降转速阿
4F：→ steve42125: 第二个问题是如果数完离心在打散 不会因为离心lost掉 11/20 08:21
5F：→ steve42125: 细胞而使得细胞数不准确吗? 11/20 08:21
如果细胞计数会明显差异，显然是有些细胞离心不下来
也就是不少死亡或状况不佳的细胞，那应该去改善你的culture流程
6F：→ steve42125: 最後是你说的分三个clone是指说一次消化一个Clone 11/20 08:21
7F：→ steve42125: 全部消化好计算好之後再开始分盘做实验? 11/20 08:22
8F：→ steve42125: 还是说一次消化一盘做好一个Clone的ABC实验分盘 再 11/20 08:23
9F：→ steve42125: 再做下个实验？ 不好意思问题有点多 再麻烦您的建议！ 11/20 08:23
10F：推 tynse71864: b 大应该是建议後者 三盘当三个实验做 11/20 09:24
11F：→ tynse71864: 目前的转速应该没问题 11/20 09:25
嗯，没错是後者
从PBS wash开始到细胞放回去养，时间越短越好
※ 编辑: blence (140.109.40.29), 11/20/2018 11:35:49
12F：推 steve42125: 了解了！ 谢谢B大 我会试试看你的建议 谢谢你！ 11/20 11:58