作者aloha17 (aloha17)
看板Biotech
標題[求救]Frustrated phagocytosis讓人好frustrated
時間Sat Oct 20 04:34:13 2018
大家好
請問有沒有人有用RAW 264.7 做frustrated phagocytosis的經驗？
我已經做了好幾個月了，卻一直做不出來，很沮喪。
我是pre-coating BSA and anti-BSA，再加RAW cells，
接著用lysotracker, BODIPY, DAPI 染色，
可是常常都在做click chemistry 的時候，
發現Raw cells 都被洗掉了，
最後照confocal 的時候只剩下邊緣的細胞，也看不到signal。
想說可能是我的protocol哪有出問題了。
p.s. 以下是我的protocol，這是從別的paper看到的，
如果有人知道哪裡有問題的話，拜託指點迷津了 。
嗚嗚 謝謝！
1) RAW cells culture in serum-free DMEM
2) Coating glass bottom dish with 3% BSA @RT 30 min
3) Wash 3 times (1 ml PBS/ per time)
4) Incubate 1 mg/ml anti-BSA @RT 30 min
5) Wash 3 times
6) Add Raw cells (150,000 in 2 ml) + 0.2 ul lysotracker @37 1hr
7) Move to cold room for 1 hr
8) Incubate @ 37 for 30 min
9) Click chemistry
- Add 2 ml DMEM + 0.2 ul Azprop (alcohol), and incubate @37 for 10 min
-Wash 3X PBS
-Add 100 ul buffer + 0.1 ul BODIPY @37 for 10 min
-Wash 3X PBS
-Add 2 ml buffer + 2 ul DAPI, and incubate @37 for 15 min
-Wash 3X PBS
-Add 2 ml buffer
-Image
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1F：推 tynse71864: glass dish 有扣 Poly-L-Lysine嗎或之類的嗎? 10/20 18:53
2F：→ aloha17: 沒有欸…開新的plate 就直接加BSA了… 10/21 13:39
3F：推 tynse71864: 要先預摳，晾乾後再摳 BSA 10/21 19:22
4F：→ tynse71864: PLL 目的是為了讓細胞貼附，沒扣大部分細胞都會貼的很 10/21 19:22
5F：→ tynse71864: 差 10/21 19:22
6F：→ aloha17: 好的 我會試試看！謝謝你的建議 10/22 05:13
7F：推 MDCCLXXVI: 有證明過BSA coat的上去嗎？ 10/23 18:08
8F：→ aloha17: 是從paper知道 先coat bsa 10/31 11:09