作者aloha17 (aloha17)
看板Biotech
标题[求救]Frustrated phagocytosis让人好frustrated
时间Sat Oct 20 04:34:13 2018
大家好
请问有没有人有用RAW 264.7 做frustrated phagocytosis的经验？
我已经做了好几个月了，却一直做不出来，很沮丧。
我是pre-coating BSA and anti-BSA，再加RAW cells，
接着用lysotracker, BODIPY, DAPI 染色，
可是常常都在做click chemistry 的时候，
发现Raw cells 都被洗掉了，
最後照confocal 的时候只剩下边缘的细胞，也看不到signal。
想说可能是我的protocol哪有出问题了。
p.s. 以下是我的protocol，这是从别的paper看到的，
如果有人知道哪里有问题的话，拜托指点迷津了 。
呜呜 谢谢！
1) RAW cells culture in serum-free DMEM
2) Coating glass bottom dish with 3% BSA @RT 30 min
3) Wash 3 times (1 ml PBS/ per time)
4) Incubate 1 mg/ml anti-BSA @RT 30 min
5) Wash 3 times
6) Add Raw cells (150,000 in 2 ml) + 0.2 ul lysotracker @37 1hr
7) Move to cold room for 1 hr
8) Incubate @ 37 for 30 min
9) Click chemistry
- Add 2 ml DMEM + 0.2 ul Azprop (alcohol), and incubate @37 for 10 min
-Wash 3X PBS
-Add 100 ul buffer + 0.1 ul BODIPY @37 for 10 min
-Wash 3X PBS
-Add 2 ml buffer + 2 ul DAPI, and incubate @37 for 15 min
-Wash 3X PBS
-Add 2 ml buffer
-Image
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1F：推 tynse71864: glass dish 有扣 Poly-L-Lysine吗或之类的吗? 10/20 18:53
2F：→ aloha17: 没有欸…开新的plate 就直接加BSA了… 10/21 13:39
3F：推 tynse71864: 要先预抠，晾乾後再抠 BSA 10/21 19:22
4F：→ tynse71864: PLL 目的是为了让细胞贴附，没扣大部分细胞都会贴的很 10/21 19:22
5F：→ tynse71864: 差 10/21 19:22
6F：→ aloha17: 好的 我会试试看！谢谢你的建议 10/22 05:13
7F：推 MDCCLXXVI: 有证明过BSA coat的上去吗？ 10/23 18:08
8F：→ aloha17: 是从paper知道 先coat bsa 10/31 11:09