作者tynse71864 (TATA box)
看板Biotech
標題[求救] lentivirus dual infection
時間Tue Jun 26 22:58:47 2018
各位版大好:
我目前想送兩個螢光fusion protein進去Jurkat T cell 裡面
拍live imaging (一個接GFP, 一個mCherry)
目前是送進去的方法有一些問題:
1.利用電轉染 2. 利用lentivirus
電轉染之前測試的結果 發現兩者同時送入細胞的比例不高，大概10%
(可能是條件沒用好電的效率太差，單就轉染效率粗估30%，我是用Biorad-Xcell)
就算有，兩者皆表現適中，適合拿來拍live的幾乎是沒了
而且每次電都要極大量的plasmid
所以目前是傾向用lenti去感染 (至少目前用起來效率較佳，表現較平均)
但目前手上只有一個lenti ovexpression vector (CMV drive的, puro resistent)
我想問說，如果我把兩色的construct都分別接入這個vector
再去感染細胞 (sequential 或同時感染)
應該會導致其中一個表現量被競爭掉?
我是否需要兩種不同promotor drive的vector呢? 還是其實不太影響?
而且同一種vector代表我無法用抗生素篩出同時表現GFP/mcherry的細胞
這也是有點為難的點...
只是中研院的pLAS系列爬以前的文，看起來titer有點低，不知是否該買下去
補: 我的cDNA+螢光蛋白大小:
Target protein是3.5k
作為marker protein的序列為1.5~2k不等，但只有一個5.2k的marker
我有點不確定virus能不能送進去
各種的建議都可以 (或是電轉染相關的建議也行)
小的第一次處理T cell，以前養Hela最常用transfect的lipo直接掰掰
有缺的資訊我會盡快補上，還請大家多多提點，謝謝!
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1F：推 ampicillin: 用2A peptide接起來 不然IRES也可以 06/27 00:08
2F：推 wang7514: 也可試試flow sorting那些double positive cells 06/27 00:30
3F：推 july81212: IRED一票 06/27 04:59
4F：→ july81212: IRES XD 用lentivirus dual infection 之前做效果沒 06/27 05:01
5F：→ july81212: 有說很好 06/27 05:01
6F：推 joseph103331: IRES+1 06/27 12:52
7F：→ joseph103331: Dual infection的話就還是要兩個不一樣的抗生素， 06/27 12:53
8F：→ joseph103331: 自己改也可以 06/27 12:53
9F：→ xxtomnyxx: 不推IRES，除了不同細胞表現效率不一樣的問題外，也不 06/27 13:56
10F：→ xxtomnyxx: 太能控制前後ORF的表現比例，推薦2A，可以確保 1:1 的 06/27 13:57
11F：→ xxtomnyxx: 表現量。你可以 A-EGFP=2A=B-mCherry=2A=PuroR 這樣 06/27 13:58
https://imgur.com/a/AMu5YH4
圖片是我的Plasmid map
先謝謝大家的建議，但由於手邊的plasmid IRES2後已經接了puro，也沒有其他切位
硬要塞成我的B fusion protein感覺有點難
2A peptide我會研究看看；不過這樣子plasmid總長度會到12k左右
會不會先卡在抽plasmid這步驟囧
另外這樣大的fusion protein不會影響到virus 的效率嗎?
12F：→ turtle24: lenti可以裝更大的 06/27 17:57
13F：→ xxtomnyxx: 用 NheI/AgeI 切開 plasmid，把 B-mCherry-2A 塞進去， 06/27 18:20
14F：→ xxtomnyxx: 2A的序列只有 60 bp 左右，可以直接加在 primer 上 06/27 18:22
15F：→ xxtomnyxx: 我會建議在 A 和 B 兩個 fusion 蛋白上裝 tag，方便用 06/27 18:23
16F：→ xxtomnyxx: 於檢查 2A cleavage 效率以及日後如果要檢測蛋白質表現 06/27 18:24
17F：→ xxtomnyxx: 時可以用。 06/27 18:24
18F：推 joseph103331: 12k不會影響抽DNA啦, Bacmid 170k都在抽了 06/27 21:14
19F：→ joseph103331: 他的mCherry跟GFP就是tag可以檢查囉 06/27 21:15
20F：→ joseph103331: 2A的影響會有需要排除嗎? 06/27 21:16
21F：→ xxtomnyxx: 對吼EGFP和mCherry就能用抗體認了...我這裡連EGFP都是 06/27 21:29
22F：→ xxtomnyxx: 用myc在做western所以沒意識到XD。一般來說2A主要就是 06/27 21:29
23F：→ xxtomnyxx: 要檢查cleavage的效率，2A本身序列很短就像tag一樣基本 06/27 21:29
24F：→ xxtomnyxx: 上可以忽略。 06/27 21:29
25F：推 johanjohan: IRES+1 06/28 07:46
26F：推 MDCCLXXVI: 2A效率不太好 06/29 20:41
27F：→ MDCCLXXVI: 切的效率 所以要注意也沒有沒切斷的 06/29 20:42
抱歉假日比較有空回:
X大的建議不錯我會試試看; 至於2A跟IRES目前上網找看好像各有利弊
(前者不一定切的段/後者表現量比較飄)
IRES由於切位實在生不出來，而且還要把puro搬家
不是很想把事情弄那麼複雜囧
28F：→ saviora: 先轉一個再sorting 接著再轉第二個 再sorting 06/29 21:30
29F：推 joseph103331: 如果有flow可用,也不用想篩藥的問題了 06/29 22:05
30F：→ joseph103331: 兩個一起感染,sorting出滿意的雙螢光細胞即可 06/29 22:06
31F：→ joseph103331: 後續還是篩藥,只是拿來保持細胞株用 06/29 22:07
近期會去學flow，只是我們所上也沒有，得去別人家借
這也是一個比較麻煩的地方
是說我想請問一下，我用lenti infect成的polyconal cells
理論上持續用puro篩藥，就能維持ovexpression gene的表現量了吧?
(就不會篩一篩螢光全沒了...我是指細胞沒養太久的情況下)
※ 編輯: tynse71864 (103.224.203.107), 06/30/2018 10:13:38