作者tynse71864 (TATA box)
看板Biotech
标题[求救] lentivirus dual infection
时间Tue Jun 26 22:58:47 2018
各位版大好:
我目前想送两个萤光fusion protein进去Jurkat T cell 里面
拍live imaging (一个接GFP, 一个mCherry)
目前是送进去的方法有一些问题:
1.利用电转染 2. 利用lentivirus
电转染之前测试的结果 发现两者同时送入细胞的比例不高，大概10%
(可能是条件没用好电的效率太差，单就转染效率粗估30%，我是用Biorad-Xcell)
就算有，两者皆表现适中，适合拿来拍live的几乎是没了
而且每次电都要极大量的plasmid
所以目前是倾向用lenti去感染 (至少目前用起来效率较佳，表现较平均)
但目前手上只有一个lenti ovexpression vector (CMV drive的, puro resistent)
我想问说，如果我把两色的construct都分别接入这个vector
再去感染细胞 (sequential 或同时感染)
应该会导致其中一个表现量被竞争掉?
我是否需要两种不同promotor drive的vector呢? 还是其实不太影响?
而且同一种vector代表我无法用抗生素筛出同时表现GFP/mcherry的细胞
这也是有点为难的点...
只是中研院的pLAS系列爬以前的文，看起来titer有点低，不知是否该买下去
补: 我的cDNA+萤光蛋白大小:
Target protein是3.5k
作为marker protein的序列为1.5~2k不等，但只有一个5.2k的marker
我有点不确定virus能不能送进去
各种的建议都可以 (或是电转染相关的建议也行)
小的第一次处理T cell，以前养Hela最常用transfect的lipo直接掰掰
有缺的资讯我会尽快补上，还请大家多多提点，谢谢!
--
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1F：推 ampicillin: 用2A peptide接起来 不然IRES也可以 06/27 00:08
2F：推 wang7514: 也可试试flow sorting那些double positive cells 06/27 00:30
3F：推 july81212: IRED一票 06/27 04:59
4F：→ july81212: IRES XD 用lentivirus dual infection 之前做效果没 06/27 05:01
5F：→ july81212: 有说很好 06/27 05:01
6F：推 joseph103331: IRES+1 06/27 12:52
7F：→ joseph103331: Dual infection的话就还是要两个不一样的抗生素， 06/27 12:53
8F：→ joseph103331: 自己改也可以 06/27 12:53
9F：→ xxtomnyxx: 不推IRES，除了不同细胞表现效率不一样的问题外，也不 06/27 13:56
10F：→ xxtomnyxx: 太能控制前後ORF的表现比例，推荐2A，可以确保 1:1 的 06/27 13:57
11F：→ xxtomnyxx: 表现量。你可以 A-EGFP=2A=B-mCherry=2A=PuroR 这样 06/27 13:58
https://imgur.com/a/AMu5YH4
图片是我的Plasmid map
先谢谢大家的建议，但由於手边的plasmid IRES2後已经接了puro，也没有其他切位
硬要塞成我的B fusion protein感觉有点难
2A peptide我会研究看看；不过这样子plasmid总长度会到12k左右
会不会先卡在抽plasmid这步骤囧
另外这样大的fusion protein不会影响到virus 的效率吗?
12F：→ turtle24: lenti可以装更大的 06/27 17:57
13F：→ xxtomnyxx: 用 NheI/AgeI 切开 plasmid，把 B-mCherry-2A 塞进去， 06/27 18:20
14F：→ xxtomnyxx: 2A的序列只有 60 bp 左右，可以直接加在 primer 上 06/27 18:22
15F：→ xxtomnyxx: 我会建议在 A 和 B 两个 fusion 蛋白上装 tag，方便用 06/27 18:23
16F：→ xxtomnyxx: 於检查 2A cleavage 效率以及日後如果要检测蛋白质表现 06/27 18:24
17F：→ xxtomnyxx: 时可以用。 06/27 18:24
18F：推 joseph103331: 12k不会影响抽DNA啦, Bacmid 170k都在抽了 06/27 21:14
19F：→ joseph103331: 他的mCherry跟GFP就是tag可以检查罗 06/27 21:15
20F：→ joseph103331: 2A的影响会有需要排除吗? 06/27 21:16
21F：→ xxtomnyxx: 对吼EGFP和mCherry就能用抗体认了...我这里连EGFP都是 06/27 21:29
22F：→ xxtomnyxx: 用myc在做western所以没意识到XD。一般来说2A主要就是 06/27 21:29
23F：→ xxtomnyxx: 要检查cleavage的效率，2A本身序列很短就像tag一样基本 06/27 21:29
24F：→ xxtomnyxx: 上可以忽略。 06/27 21:29
25F：推 johanjohan: IRES+1 06/28 07:46
26F：推 MDCCLXXVI: 2A效率不太好 06/29 20:41
27F：→ MDCCLXXVI: 切的效率 所以要注意也没有没切断的 06/29 20:42
抱歉假日比较有空回:
X大的建议不错我会试试看; 至於2A跟IRES目前上网找看好像各有利弊
(前者不一定切的段/後者表现量比较飘)
IRES由於切位实在生不出来，而且还要把puro搬家
不是很想把事情弄那麽复杂囧
28F：→ saviora: 先转一个再sorting 接着再转第二个 再sorting 06/29 21:30
29F：推 joseph103331: 如果有flow可用,也不用想筛药的问题了 06/29 22:05
30F：→ joseph103331: 两个一起感染,sorting出满意的双萤光细胞即可 06/29 22:06
31F：→ joseph103331: 後续还是筛药,只是拿来保持细胞株用 06/29 22:07
近期会去学flow，只是我们所上也没有，得去别人家借
这也是一个比较麻烦的地方
是说我想请问一下，我用lenti infect成的polyconal cells
理论上持续用puro筛药，就能维持ovexpression gene的表现量了吧?
(就不会筛一筛萤光全没了...我是指细胞没养太久的情况下)
※ 编辑: tynse71864 (103.224.203.107), 06/30/2018 10:13:38