作者j67897 (E-sou )
看板Biotech
標題[求救] Linker活化、EDC/NHS、antibody鍵結問題
時間Wed May 16 18:22:17 2018
大家好，小弟想問一下Linker活化、並鍵結抗體的相關問題
先簡述我的實驗步驟：
1.在金層上利用Au-S 鍵結SAMs層(使用Linker為8-巯基辛酸)，末端為COOH
2.利用EDC/NHS活化Linker
3.滴定抗體使抗體鍵結於Linker上。
爬了版上另一篇詢問的文章以及學長論文得知
EDC和NHS是活化COOH基用的，EDC先和COOH基反應，然後再由NHS和這個基團反應，
:: 最後變成 R-C=O -NHS的反應基團，接下來就可以和帶有 R2-NH2的基團反應
論文中是寫EDC/NHS改質Linker的羧基COOH，使其易與抗體的胺基產生肽鍵。
如果以上沒錯的話代表Linker是與抗體的NH2反應，可是抗體的NH2鍵長在Y字型的
上面兩個點，那裏同時也是抗原進行專一性鍵結的地方，
這樣不就代表抗體應該是倒插在我的SAMs層上嗎?，為什麼文獻都是畫正的Y呢?
目前的猜想是所謂的NH2只是抗體重鏈中的某個側鏈，而不是Y頂端的抗原結合點
沒有生物化學背景來這邊問問題商大家的眼睛了抱歉，
煩請大大願意耐心幫我解答一下，謝謝
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1F：推 hihijoker: 隨機方向鍵結到SAM 05/16 19:42
2F：→ j67897: 所以的確是與抗體中的NH2鍵結，但是是隨機方向的NH2囉? 05/16 20:40
3F：推 shmin: 抗體上有太多可以反應的地方 05/16 20:56
4F：推 Ianthegood: 隨機插上所有的N-ter跟lysine/arginine的side chain 05/17 01:20
5F：→ Ianthegood: 當然機率是一個 構型也要考慮 05/17 01:20
6F：→ j67897: 那文獻中抗體都是Y字型插在表面只是方便示意而以囉?實際上 05/17 13:30
7F：→ j67897: 不一定是這個方向 05/17 13:30
8F：→ j67897: 想在請問一下除了螢光外，有什麼方式可以確認抗體OR抗原 05/17 13:31
9F：→ j67897: 有佈植上去呢? 單純顯微鏡可嗎?目前是想用XPS看表面元素 05/17 13:32
10F：→ Ianthegood: 顯微鏡可以啊 跑一張IF 05/18 00:08
11F：推 ChesterYeah: EDC NHS 就是做amide bond形成在用 主要形成diimide 05/25 07:58
12F：→ ChesterYeah: 再被有親核劑攻擊 形成新的bond 05/25 07:59
13F：→ ChesterYeah: 簡單說就是可以加快反應用的 05/25 07:59
14F：推 MDCCLXXVI: 隨機接 所以會東倒西歪 Y字型朝上只是好看用的 06/13 00:39
15F：推 NSB35573: 定性的話，可以用 cd spectrum 去測你純化後的產物有沒 07/20 12:46
16F：→ NSB35573: 有抗體的訊號。 07/20 12:46
17F：→ NSB35573: 另外，如果你做的東西是particles,粒徑至少要大於50~100 07/20 12:46
18F：→ NSB35573: nm，可先利用EDC/NHS有螢光的抗體接上後，再用confocal 07/20 12:46
19F：→ NSB35573: 顯微鏡看螢光影像。 07/20 12:46
20F：→ NSB35573: 07/20 12:46
21F：→ NSB35573: 要定抗體接上去的量，用protein assay，例如Bradford as 07/20 12:46
22F：→ NSB35573: say。 07/20 12:46
23F：→ NSB35573: 然後這反應很毒.. 07/20 12:47