http://blog.addgene.org/site-directed-mutagenesis-by-pcr 以前我大約照上面這 protocol，一般都能做出來 有時候我的 primer 會設計到接近 40 bp 通常做不出來都是 PCR product 太少，跑 gel 看不到， DpnI 切完後直接 transform 又跟 uncut template 的 background colony 混在一起 尤其你的 plasmid 有 6k 多，有些失敗的機率 1.我建議可以分析一下 primer，看看有沒有 primer dimer 等其他問題 https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html 好的 primer 設計可以增加產率 2.解決後我會試 HF, GC, GC+5%DMSO 三種 buffer，最好是 fresh aliquot 的 3.可以考慮先PCR 15個 cycle， 中間打開加新的酵素跟 dNTP，然後再PCR 15個 cycle 如果這樣做都看不到 band，那可能要重新設計 primer 了 4.記得做對照組 (沒加 primer 但是有 template) transform 的時候對照組也做，這樣就知道有多少是 background colony 5.真的不行可以換到小一點的 plasmid 做 (例如 TA subcloning 到小的 vector) 祝好運! ※ 引述《shauosan ()》之銘言： : 最近在做A基因靠近3端不足100bp的點突變, : primer設計如下: : F -----m-----------> : 5' ------------------------------------------------------3' : |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| : ------------------------------------------------------ : <------------m----- R : Forword primer長度30bp : Reverse primer長度32bp，m為突變位置，兩條primer中間overlap 10bp， : Tm值都大約60、61左右， : 目標為6.6kb左右的plasmid，但我一直都P不出來。 : PCR材料照phusion產品說明的: : ddH2O add to 20ul : 5X Phusion HF buffer 4ul : 10mM dNTPs 0.4ul : Forward primer 1ul : Reverse primer 1ul (primer final concentraction 0.5uM) : template 1ul : 3% DMSO 0.6ul : phusion 0.2ul : __________________________________________ : total volumn 20ul : PCR condition: : 98℃ 30s __ : 98℃ 10s | : 55℃ 30s | 25cycle : 72℃ 3min20s _| : 72℃ 5min : 25℃ ∞ : template有試過放不同量0.1ng、1ng、5ng、10ng，有加DMSO or 沒加， : 但PCR一直都跑不出來， : 後來有試著用DpnI digest後再拿去transform看看，有長colony，但都萃不到質體。 : 之前在文獻有看到有人說靠近3端的點突變不能直接做， : 那篇是用兩條延伸到plasmid的primer做，接著進行融合PCR，最後在clone回質體， : 不知道這會不會是p不出來的原因? : (可是plasmid不是圓的嗎?問了實驗室有在做的人都覺得這說法不太合理) : 因為之前沒經驗，問了實驗室的人才知道他們都是用complement priemr做， : 目前想到的就是重訂primer， : 不知道版友對於這個情況有沒有什麼建議? -- 1. 似乎在高中學過...的公式 7. 你能測度真正的內心嗎? 2. 那真是太令人高興了 8. 我，真是個笨蛋 3. 已經沒什麼好學習的了 9. 那樣的公理，我絕不容許 4. 極限、微分，都是存在的 10. 再也不可數的空間維度 5. 怎麼可能會發散 11. 最後收歛的 Banach space 6. 不可積絕對很奇怪啊 12. 我最愛的連續函數 <實分析少女小圓> --

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