http://blog.addgene.org/site-directed-mutagenesis-by-pcr 以前我大约照上面这 protocol，一般都能做出来 有时候我的 primer 会设计到接近 40 bp 通常做不出来都是 PCR product 太少，跑 gel 看不到， DpnI 切完後直接 transform 又跟 uncut template 的 background colony 混在一起 尤其你的 plasmid 有 6k 多，有些失败的机率 1.我建议可以分析一下 primer，看看有没有 primer dimer 等其他问题 https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html 好的 primer 设计可以增加产率 2.解决後我会试 HF, GC, GC+5%DMSO 三种 buffer，最好是 fresh aliquot 的 3.可以考虑先PCR 15个 cycle， 中间打开加新的酵素跟 dNTP，然後再PCR 15个 cycle 如果这样做都看不到 band，那可能要重新设计 primer 了 4.记得做对照组 (没加 primer 但是有 template) transform 的时候对照组也做，这样就知道有多少是 background colony 5.真的不行可以换到小一点的 plasmid 做 (例如 TA subcloning 到小的 vector) 祝好运! ※ 引述《shauosan ()》之铭言： : 最近在做A基因靠近3端不足100bp的点突变, : primer设计如下: : F -----m-----------> : 5' ------------------------------------------------------3' : |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| : ------------------------------------------------------ : <------------m----- R : Forword primer长度30bp : Reverse primer长度32bp，m为突变位置，两条primer中间overlap 10bp， : Tm值都大约60、61左右， : 目标为6.6kb左右的plasmid，但我一直都P不出来。 : PCR材料照phusion产品说明的: : ddH2O add to 20ul : 5X Phusion HF buffer 4ul : 10mM dNTPs 0.4ul : Forward primer 1ul : Reverse primer 1ul (primer final concentraction 0.5uM) : template 1ul : 3% DMSO 0.6ul : phusion 0.2ul : __________________________________________ : total volumn 20ul : PCR condition: : 98℃ 30s __ : 98℃ 10s | : 55℃ 30s | 25cycle : 72℃ 3min20s _| : 72℃ 5min : 25℃ ∞ : template有试过放不同量0.1ng、1ng、5ng、10ng，有加DMSO or 没加， : 但PCR一直都跑不出来， : 後来有试着用DpnI digest後再拿去transform看看，有长colony，但都萃不到质体。 : 之前在文献有看到有人说靠近3端的点突变不能直接做， : 那篇是用两条延伸到plasmid的primer做，接着进行融合PCR，最後在clone回质体， : 不知道这会不会是p不出来的原因? : (可是plasmid不是圆的吗?问了实验室有在做的人都觉得这说法不太合理) : 因为之前没经验，问了实验室的人才知道他们都是用complement priemr做， : 目前想到的就是重订primer， : 不知道版友对於这个情况有没有什麽建议? -- 1. 似乎在高中学过...的公式 7. 你能测度真正的内心吗? 2. 那真是太令人高兴了 8. 我，真是个笨蛋 3. 已经没什麽好学习的了 9. 那样的公理，我绝不容许 4. 极限、微分，都是存在的 10. 再也不可数的空间维度 5. 怎麽可能会发散 11. 最後收歛的 Banach space 6. 不可积绝对很奇怪啊 12. 我最爱的连续函数 <实分析少女小圆> --

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