作者linpooh1029 (linpooh1029)
看板Biotech
標題[求救] DNase處理後仍有gDNA
時間Wed Apr 25 10:09:10 2018
目前用exiqon RNA isolation kit, 照上面建議的protocol DNase(biolab) 0.375U/uL，25
-30度反應20分鐘，和37度10分鐘(biolab建議),出來的gel還是有gDNA。
想問是還要拉長時間還是濃度增加?我是要for miRNA，抽了好幾匹組織還是有gDNA污染，想
請大家幫幫忙。
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1F：推 lingon: DNase用多了會影響RNA品質,可以考量下游的試驗需要多純的 04/25 10:30
2F：→ lingon: RNA再決定如何處理 04/25 10:30
3F：→ xxtomnyxx: 抽 RNA 有 gDNA 參雜其實很常見，主要是看你後續的實驗 04/25 14:14
4F：→ xxtomnyxx: 會不會被 gDNA 干擾，不會的話就可以不理它 04/25 14:14
5F：推 joseph103331: gDNA很難完全去除,所以control會一大堆 04/25 14:16
6F：→ joseph103331: 主要原因之一就是排除gDNA的訊號 04/25 14:16
7F：→ linpooh1029: 我是用在miRNA qpcr, primer 設計辨認poly A,但我們 04/25 15:25
8F：→ linpooh1029: 是認為g DNA上也會有會影響到 04/25 15:25
9F：→ linpooh1029: @lingon 我出來的DNA量在gel都是多於RNA的QQ 04/25 17:47
10F：→ xxtomnyxx: miRNA qPRC primer 怎麼會設計在 polyA 上？ 04/25 18:53
12F：→ linpooh1029: 我們miRNA也是用kit的 04/25 19:03
13F：推 joseph103331: 同樓上問題 04/25 19:04
14F：推 joseph103331: polyA感覺是自己加上去的 04/25 19:06
15F：→ xxtomnyxx: 嗯，你放那張圖不妥，省略掉 polyA polymerase 的處理 04/25 20:31
16F：→ xxtomnyxx: 會讓人困惑。 04/25 20:31
17F：→ xxtomnyxx: 從這個實驗的原理看來 gDNA 理論上不會有影響。你要是 04/25 20:37
18F：→ xxtomnyxx: 真的擔心會有影響，就做幾次拿少量你抽的 RNA 用 RNase 04/25 20:37
19F：→ xxtomnyxx: A 處理過再做一樣的 polyadenylation、RT 和 qPCR。 04/25 20:37
20F：→ xxtomnyxx: 測不到訊號就表示不會有影響。 04/25 20:37
21F：→ xxtomnyxx: 另外，column 抽 RNA 真的要抽得很爛才會 gDNA 比 RNA 04/25 20:39
22F：→ xxtomnyxx: 多，一般這都是表示你 sample over loading 了 04/25 20:39
23F：推 huuban: 看你的樣本吧..如果是非模式物種真的甚麼怪事都會有的 04/25 21:45
24F：→ huuban: 我以前玩LNA miRNA qPCR的DNase是用別的牌子做的 04/25 21:46
25F：→ huuban: 吃不乾淨我們會再吃一趟，通常兩趟會乾淨的 04/25 21:47
26F：→ linpooh1029: 這圖是kit附的哈哈， 他是後來加上polya沒錯，但就 04/25 21:59
27F：→ linpooh1029: 是怕那段reverse primer會跑到gdna，不知道前輩們覺 04/25 21:59
28F：→ linpooh1029: 得有沒有可能QQ 04/25 21:59
29F：→ linpooh1029: 我是抽mice embryo 現在是拿embryo不要的部位測試ki 04/25 22:01
30F：→ linpooh1029: t。 04/25 22:01
31F：→ linpooh1029: 謝謝各位大大的幫忙QQ 04/25 22:01
32F：推 bioresearch: Biorad好像有kit可以解決，業務推過，問問應該有 05/29 22:27