作者fishg1216 (葉綠體)
看板Biotech
標題[求救] XbaI 限制酶digestion切不完整
時間Fri Mar 16 17:53:51 2018
大家好!
最近我要做southern blot檢測轉殖株基因體內轉基因套數，但在digestion發生了問題!
由於老闆要求需要分別用三個不同限制酶檢測套數，於是我選用了EcoRI, BamHI及XbaI。
前兩個酵素都很成功的將不同轉殖株wild type和positive control 之15 ug DNA切割成s
mearing條帶，但XbaI卻在少數三管DNA (包含wild type, 如下圖 5th, 10th, 25th well
) digested不完全, 因此想求助大家原因出在哪裡?
謝謝大家!
https://i.imgur.com/1d8WgEc.jpg
以下附上digestion 條件
DNA 15 ug
10X buffer Tango 2 ul
Fermentas XbaI (10U/ul) 2 ul
補dH2O至體積為20 ul
37℃ 16小時
註:
1. 三支酵素digestion條件完全相同,差別只在使用的buffer種類不同
2.皆使用同一管DNA
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.120.190.247
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1F：推 joseph103331: DNA methylation? 找一個沒有methylation影響的酵素 03/16 18:12
2F：→ joseph103331: 吧~ 03/16 18:12
3F：推 tynse71864: xbai 有些會有甲基化喔 會切不動 03/16 19:42
4F：→ a90648: XbaI要注意用的菌種，methylation後會切不動 03/17 00:09
5F：推 july81212: XbaI遇到methylation 就且不動喔 換菌種看看 03/17 00:29
謝謝大家的回應，但昨天我換了一支酵素NEB的PvuII，切 1 ug DNA，其他條件相同，
仍然切不動。有查過NEB網站確認過PvuII不會受甲基化影響，請問會是什麼原因?
※ 編輯: fishg1216 (140.120.190.245), 03/17/2018 12:39:26
7F：推 joseph103331: 有沒有Non-digested作為control? 03/17 13:31
8F：→ blence: XbaI是對dam敏感,但你的轉殖株應該沒有這種methylase吧 03/18 16:40
9F：→ fishg1216: to j大，不好意思沒做cotrol; to b大，怎樣確認有無 03/19 11:21
10F：→ fishg1216: 此methylase? 謝謝! 03/19 11:21
11F：→ blence: 我是回應前面推文都提到菌種,可是你只提到轉殖株,沒說是菌 03/19 12:24
12F：→ blence: Ecoli才有dam,就算XbaI對dam敏感,也要看你用轉殖株是什麼 03/19 12:26
13F：→ fishg1216: 轉殖株材料是番茄 03/21 18:05