作者fishg1216 (叶绿体)
看板Biotech
标题[求救] XbaI 限制酶digestion切不完整
时间Fri Mar 16 17:53:51 2018
大家好!
最近我要做southern blot检测转殖株基因体内转基因套数，但在digestion发生了问题!
由於老板要求需要分别用三个不同限制酶检测套数，於是我选用了EcoRI, BamHI及XbaI。
前两个酵素都很成功的将不同转殖株wild type和positive control 之15 ug DNA切割成s
mearing条带，但XbaI却在少数三管DNA (包含wild type, 如下图 5th, 10th, 25th well
) digested不完全, 因此想求助大家原因出在哪里?
谢谢大家!
https://i.imgur.com/1d8WgEc.jpg
以下附上digestion 条件
DNA 15 ug
10X buffer Tango 2 ul
Fermentas XbaI (10U/ul) 2 ul
补dH2O至体积为20 ul
37℃ 16小时
注:
1. 三支酵素digestion条件完全相同,差别只在使用的buffer种类不同
2.皆使用同一管DNA
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1F：推 joseph103331: DNA methylation? 找一个没有methylation影响的酵素 03/16 18:12
2F：→ joseph103331: 吧~ 03/16 18:12
3F：推 tynse71864: xbai 有些会有甲基化喔 会切不动 03/16 19:42
4F：→ a90648: XbaI要注意用的菌种，methylation後会切不动 03/17 00:09
5F：推 july81212: XbaI遇到methylation 就且不动喔 换菌种看看 03/17 00:29
谢谢大家的回应，但昨天我换了一支酵素NEB的PvuII，切 1 ug DNA，其他条件相同，
仍然切不动。有查过NEB网站确认过PvuII不会受甲基化影响，请问会是什麽原因?
※ 编辑: fishg1216 (140.120.190.245), 03/17/2018 12:39:26
7F：推 joseph103331: 有没有Non-digested作为control? 03/17 13:31
8F：→ blence: XbaI是对dam敏感,但你的转殖株应该没有这种methylase吧 03/18 16:40
9F：→ fishg1216: to j大，不好意思没做cotrol; to b大，怎样确认有无 03/19 11:21
10F：→ fishg1216: 此methylase? 谢谢! 03/19 11:21
11F：→ blence: 我是回应前面推文都提到菌种,可是你只提到转殖株,没说是菌 03/19 12:24
12F：→ blence: Ecoli才有dam,就算XbaI对dam敏感,也要看你用转殖株是什麽 03/19 12:26
13F：→ fishg1216: 转殖株材料是番茄 03/21 18:05