作者sean831009 (雷菜包)
看板Biotech
標題[求救] Parental篩選不死
時間Mon Feb 12 00:07:39 2018
想請問板上的大大們
小弟我最近在做Lentivirus transfection
但是轉染完後做puromycin篩選時
我的parental細胞都不太死
反而是有轉染的細胞死的還比較多
我已經做第二次了還是類似的結果
請問我的問題可能出在哪
有任何比較合理的解釋嗎
或是可以怎麼解決呢
感恩各位
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1F：→ joseph103331: 做lenti前你要先準備好篩選條件,先測試puro在你們的02/12 09:10
有 我有先做MTT assay 但我一開始選用的濃度跟這次篩選情況一樣 甚至我還提高puromycin濃度 但還是一樣
還是我的問題可能出在我的MTT assay
2F：→ joseph103331: 細胞裡的dose再來談lenti的dose 02/12 09:10
※ 編輯: sean831009 (120.126.51.183), 02/12/2018 13:07:46
3F：→ tynse71864: 標題得改一下 02/12 14:10
※ 編輯: sean831009 (120.126.51.183), 02/12/2018 21:15:26
4F：→ tynse71864: 我其實是說標題的格式啦XDD 02/13 18:52
怎麼弄??
※ 編輯: sean831009 (120.126.104.55), 02/14/2018 00:56:40
5F：→ ithinksoiam: 少了一個空格 跟其他人要對齊 02/14 08:35
※ 編輯: sean831009 (120.126.51.183), 02/22/2018 20:59:26
6F：→ blence: 看不懂對你joseph回覆;到底一開始選用的濃度細胞死光了沒? 02/22 21:29
沒有
※ 編輯: sean831009 (120.126.106.62), 02/24/2018 03:12:40
7F：→ cyh1220: parental 的問題有可能你puromycin的濃度不夠，所以殺不 03/18 23:48
8F：→ cyh1220: 死，建議再測一次IC50。至於你的轉染細胞死一堆有可能是 03/18 23:48
我MTT assay已經又重做一次了 結果parental有死一些 但大部分還是貼著繼續長 我在想會不會是package的問題 可能送進去的質體量不夠 但從我的結果看來 如果我沒有package成功 我轉染應該也不會成功 但parental就是不死 或是你可以提供protocol嗎 我想比較一下謝謝
9F：→ cyh1220: 轉染沒有成功，加上轉染的壓力導致細胞變得脆弱 03/18 23:48
※ 編輯: sean831009 (120.126.51.183), 03/19/2018 10:50:12
10F：→ blence: 一開始選用的濃度,對細胞都細胞沒有毒性了,跟質體,package 03/20 09:02
11F：→ blence: 有什麼關係? 03/20 09:02
12F：→ blence: 別管MTT,別管轉染了,好好的"只"檢查puro對操作細胞的IC50 03/20 09:04
但是加不同濃度的puro不是就是MTT嗎?
我的意思是原本測IC50會死的濃度 等我加了protamine sulfate之後再用原本IC50的puro濃度就不會死了
13F：→ blence: 應該不麻煩吧？ 03/20 09:04
14F：→ blence: 只是細胞+不同濃度puro,連續三天顯微鏡觀察存活情況就好 03/20 09:07
15F：推 tynse71864: 哪種細胞阿？ 有些細胞本身對 puro非常有抗性，所以才 03/20 23:54
B16F10
murine melanoma cell
但我已經看過他對puro沒有抗性啊
16F：→ tynse71864: 怎麼差都殺不死 (我目前也遇到) 03/20 23:54
17F：→ tynse71864: 同 B大，不用管看 MTT 了；測試2,4,6,8,10 ug/ml看看 03/20 23:59
18F：→ tynse71864: 哪時候會死 03/20 23:59
19F：→ tynse71864: 如果都不會死可能是 1.你細胞本身就抗puro,需要別種的 03/20 23:59
20F：→ tynse71864: selection marker; 這個資料可以在 ATCC找，通常是最 03/20 23:59
21F：→ tynse71864: 初 immortalize時篩選用的 2.puro壞了 03/20 23:59
22F：→ tynse71864: 理論上 parental應該要幾乎全死 03/21 00:00
※ 編輯: sean831009 (211.21.125.231), 06/15/2018 16:36:49
※ 編輯: sean831009 (211.21.125.231), 06/15/2018 16:39:35