作者sean831009 (雷菜包)
看板Biotech
标题[求救] Parental筛选不死
时间Mon Feb 12 00:07:39 2018
想请问板上的大大们
小弟我最近在做Lentivirus transfection
但是转染完後做puromycin筛选时
我的parental细胞都不太死
反而是有转染的细胞死的还比较多
我已经做第二次了还是类似的结果
请问我的问题可能出在哪
有任何比较合理的解释吗
或是可以怎麽解决呢
感恩各位
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1F：→ joseph103331: 做lenti前你要先准备好筛选条件,先测试puro在你们的02/12 09:10
有 我有先做MTT assay 但我一开始选用的浓度跟这次筛选情况一样 甚至我还提高puromycin浓度 但还是一样
还是我的问题可能出在我的MTT assay
2F：→ joseph103331: 细胞里的dose再来谈lenti的dose 02/12 09:10
※ 编辑: sean831009 (120.126.51.183), 02/12/2018 13:07:46
3F：→ tynse71864: 标题得改一下 02/12 14:10
※ 编辑: sean831009 (120.126.51.183), 02/12/2018 21:15:26
4F：→ tynse71864: 我其实是说标题的格式啦XDD 02/13 18:52
怎麽弄??
※ 编辑: sean831009 (120.126.104.55), 02/14/2018 00:56:40
5F：→ ithinksoiam: 少了一个空格 跟其他人要对齐 02/14 08:35
※ 编辑: sean831009 (120.126.51.183), 02/22/2018 20:59:26
6F：→ blence: 看不懂对你joseph回覆;到底一开始选用的浓度细胞死光了没? 02/22 21:29
没有
※ 编辑: sean831009 (120.126.106.62), 02/24/2018 03:12:40
7F：→ cyh1220: parental 的问题有可能你puromycin的浓度不够，所以杀不 03/18 23:48
8F：→ cyh1220: 死，建议再测一次IC50。至於你的转染细胞死一堆有可能是 03/18 23:48
我MTT assay已经又重做一次了 结果parental有死一些 但大部分还是贴着继续长 我在想会不会是package的问题 可能送进去的质体量不够 但从我的结果看来 如果我没有package成功 我转染应该也不会成功 但parental就是不死 或是你可以提供protocol吗 我想比较一下谢谢
9F：→ cyh1220: 转染没有成功，加上转染的压力导致细胞变得脆弱 03/18 23:48
※ 编辑: sean831009 (120.126.51.183), 03/19/2018 10:50:12
10F：→ blence: 一开始选用的浓度,对细胞都细胞没有毒性了,跟质体,package 03/20 09:02
11F：→ blence: 有什麽关系? 03/20 09:02
12F：→ blence: 别管MTT,别管转染了,好好的"只"检查puro对操作细胞的IC50 03/20 09:04
但是加不同浓度的puro不是就是MTT吗?
我的意思是原本测IC50会死的浓度 等我加了protamine sulfate之後再用原本IC50的puro浓度就不会死了
13F：→ blence: 应该不麻烦吧？ 03/20 09:04
14F：→ blence: 只是细胞+不同浓度puro,连续三天显微镜观察存活情况就好 03/20 09:07
15F：推 tynse71864: 哪种细胞阿？ 有些细胞本身对 puro非常有抗性，所以才 03/20 23:54
B16F10
murine melanoma cell
但我已经看过他对puro没有抗性啊
16F：→ tynse71864: 怎麽差都杀不死 (我目前也遇到) 03/20 23:54
17F：→ tynse71864: 同 B大，不用管看 MTT 了；测试2,4,6,8,10 ug/ml看看 03/20 23:59
18F：→ tynse71864: 哪时候会死 03/20 23:59
19F：→ tynse71864: 如果都不会死可能是 1.你细胞本身就抗puro,需要别种的 03/20 23:59
20F：→ tynse71864: selection marker; 这个资料可以在 ATCC找，通常是最 03/20 23:59
21F：→ tynse71864: 初 immortalize时筛选用的 2.puro坏了 03/20 23:59
22F：→ tynse71864: 理论上 parental应该要几乎全死 03/21 00:00
※ 编辑: sean831009 (211.21.125.231), 06/15/2018 16:36:49
※ 编辑: sean831009 (211.21.125.231), 06/15/2018 16:39:35