作者tynse71864 (TATA box)
看板Biotech
標題[求救] NEB stable competent E.coli
時間Sun Feb 11 22:54:53 2018
各位版友們晚安
小的最近需要作lentivirus infection
所以使用了NEB stable competent cell (C3040) 作為vector 轉入之菌種
以避免重組現象的發生
但由於之前在別的Lab都是使用Ecos的stbl3
想知道NEB這個competent cell:
1.protocol建議是plate 養30度24小時 或37度o/n
但他又說37度有機率突變 是說在37養太久就會突變嗎?
或是這類的只要養在37度 不論時間都有可能得到錯誤的序列?
2.culture medium 需要用 TB / LB? 以及時間?
plate目前我自己是養30度18h (LB/amp plate) 就有看到菌落
但拿去抽mini (30度24h, 2ml , LB/Amp medium) 濃度很低
總共大約1ug而已, plasmid ~8k 大
(目前是暫時夠我用，我只是怕到時抽midi產量一樣這麼低)
而NEB的網頁全都只有寫到plate o/n這步驟...後續都沒有提及
若有使用過這株菌的板友們 希望能給小的一些建議
謝謝各位
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 123.193.43.81
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1518360896.A.B20.html
1F：推 ABULA666: 影響序列容不容易有突變是因細菌分裂過快，導致你原本 02/12 08:31
2F：→ ABULA666: 放入的序列會因細菌裡一些酵素而改變。就我之前看過的 02/12 08:31
3F：→ ABULA666: 文獻跟自身經驗，溫度影響序列的因素遠大於養菌時間，因 02/12 08:31
4F：→ ABULA666: 此如果你的序列在E.coli極不穩定，是有可能在37度下培養 02/12 08:31
5F：→ ABULA666: 發生突變，因此面對像lentivirus這類有重複序列，還是 02/12 08:31
6F：→ ABULA666: 建議先從30度或更低溫度下手。至於時間問題，是當你的 02/12 08:31
7F：→ ABULA666: 細菌真的培養太久(兩天以上)，細菌可能因環境壓力而導致 02/12 08:31
8F：→ ABULA666: 修剪序列。另外培養液/基建議使用LB即可，不建議用TB也 02/12 08:31
9F：→ ABULA666: 是考慮避免細菌增值過快。基本上降低溫度就會降低菌內pl 02/12 08:31
10F：→ ABULA666: asmid的copy number，因此你萃取出的量就會不多，若需 02/12 08:31
11F：→ ABULA666: 更多量請放大養菌量。 02/12 08:31
12F：推 joseph103331: 有些lentiviral vector極不穩定,transform一批可以 02/12 09:06
13F：→ joseph103331: 有20%以上產生重組(非文獻,自己的經驗),這類的copy 02/12 09:07
14F：→ joseph103331: 就是很低,但抽質體的重點在於正確不在多,用midi回溶 02/12 09:08
15F：→ joseph103331: 少一點也夠你用的 02/12 09:08
16F：→ joseph103331: 我也做過穩定的lentivector,1uL就有1ug,嚇死人 02/12 09:09
感謝A大跟J大的詳細說明!
所以倘若已使用30度來culture, 仍會建議在抽完plasmid後
做整個plasmid的sequence嗎? (我家也是第一次用這個vector)
※ 編輯: tynse71864 (140.109.113.61), 02/12/2018 14:27:24
17F：推 joseph103331: 我們主要發生的問題是recombination,跑電泳即可知道02/12 14:56
18F：→ joseph103331: 也可以跑電泳+設計限制酶切位會更安心02/12 14:57
19F：→ joseph103331: 當然預算沒問題就定序也行啦,不過就要等兩天才能用02/12 14:57
20F：推 ABULA666: 預算、時間夠就定序吧，以免有任何不確定性在02/12 18:11
21F：推 hitmd: 使用上有疑問可致電諾貝爾詢問喔，請產專幫您解決02/25 11:57
後來送全序列定序，皆與當初設計的相同
謝謝熱心的版友們!
※ 編輯: tynse71864 (114.137.83.94), 02/28/2018 20:37:54
22F：→ blence: Ecoli transformation的過程幾乎不會有單一ATCG的突變啦02/28 21:37
23F：→ blence: 這裡講突變,像是說某某菌容易突變,指的都是序列發生重組02/28 21:37
24F：→ blence: 跟PCR不同,聚合欅在超長片段的突變,才會在nuclotide層次02/28 21:41
25F：→ blence: 所以對於viral vector只有透過PCR增減的片段才需要訂序02/28 21:45
26F：→ blence: 單純的transfrom只需要用酵素看切出的pattern即可02/28 21:47
27F：→ blence: 最好是用切出3~5片段的酵素組合,不適合只用單一切點觀察02/28 21:49
28F：→ blence: 而且每次重新transform都要做,因為上面joseph提到的狀況02/28 21:51
因為沒做過這種 vector ,前段時間又卡在很基本的cloning……有點怕到 就直接送 seq了
下次我建立我會直接用 RE切來確認 ，謝謝 B大
※ 編輯: tynse71864 (223.136.213.163), 03/16/2018 09:18:46