作者tynse71864 (TATA box)
看板Biotech
标题[求救] NEB stable competent E.coli
时间Sun Feb 11 22:54:53 2018
各位版友们晚安
小的最近需要作lentivirus infection
所以使用了NEB stable competent cell (C3040) 作为vector 转入之菌种
以避免重组现象的发生
但由於之前在别的Lab都是使用Ecos的stbl3
想知道NEB这个competent cell:
1.protocol建议是plate 养30度24小时 或37度o/n
但他又说37度有机率突变 是说在37养太久就会突变吗?
或是这类的只要养在37度 不论时间都有可能得到错误的序列?
2.culture medium 需要用 TB / LB? 以及时间?
plate目前我自己是养30度18h (LB/amp plate) 就有看到菌落
但拿去抽mini (30度24h, 2ml , LB/Amp medium) 浓度很低
总共大约1ug而已, plasmid ~8k 大
(目前是暂时够我用，我只是怕到时抽midi产量一样这麽低)
而NEB的网页全都只有写到plate o/n这步骤...後续都没有提及
若有使用过这株菌的板友们 希望能给小的一些建议
谢谢各位
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 123.193.43.81
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1F：推 ABULA666: 影响序列容不容易有突变是因细菌分裂过快，导致你原本 02/12 08:31
2F：→ ABULA666: 放入的序列会因细菌里一些酵素而改变。就我之前看过的 02/12 08:31
3F：→ ABULA666: 文献跟自身经验，温度影响序列的因素远大於养菌时间，因 02/12 08:31
4F：→ ABULA666: 此如果你的序列在E.coli极不稳定，是有可能在37度下培养 02/12 08:31
5F：→ ABULA666: 发生突变，因此面对像lentivirus这类有重复序列，还是 02/12 08:31
6F：→ ABULA666: 建议先从30度或更低温度下手。至於时间问题，是当你的 02/12 08:31
7F：→ ABULA666: 细菌真的培养太久(两天以上)，细菌可能因环境压力而导致 02/12 08:31
8F：→ ABULA666: 修剪序列。另外培养液/基建议使用LB即可，不建议用TB也 02/12 08:31
9F：→ ABULA666: 是考虑避免细菌增值过快。基本上降低温度就会降低菌内pl 02/12 08:31
10F：→ ABULA666: asmid的copy number，因此你萃取出的量就会不多，若需 02/12 08:31
11F：→ ABULA666: 更多量请放大养菌量。 02/12 08:31
12F：推 joseph103331: 有些lentiviral vector极不稳定,transform一批可以 02/12 09:06
13F：→ joseph103331: 有20%以上产生重组(非文献,自己的经验),这类的copy 02/12 09:07
14F：→ joseph103331: 就是很低,但抽质体的重点在於正确不在多,用midi回溶 02/12 09:08
15F：→ joseph103331: 少一点也够你用的 02/12 09:08
16F：→ joseph103331: 我也做过稳定的lentivector,1uL就有1ug,吓死人 02/12 09:09
感谢A大跟J大的详细说明!
所以倘若已使用30度来culture, 仍会建议在抽完plasmid後
做整个plasmid的sequence吗? (我家也是第一次用这个vector)
※ 编辑: tynse71864 (140.109.113.61), 02/12/2018 14:27:24
17F：推 joseph103331: 我们主要发生的问题是recombination,跑电泳即可知道02/12 14:56
18F：→ joseph103331: 也可以跑电泳+设计限制酶切位会更安心02/12 14:57
19F：→ joseph103331: 当然预算没问题就定序也行啦,不过就要等两天才能用02/12 14:57
20F：推 ABULA666: 预算、时间够就定序吧，以免有任何不确定性在02/12 18:11
21F：推 hitmd: 使用上有疑问可致电诺贝尔询问喔，请产专帮您解决02/25 11:57
後来送全序列定序，皆与当初设计的相同
谢谢热心的版友们!
※ 编辑: tynse71864 (114.137.83.94), 02/28/2018 20:37:54
22F：→ blence: Ecoli transformation的过程几乎不会有单一ATCG的突变啦02/28 21:37
23F：→ blence: 这里讲突变,像是说某某菌容易突变,指的都是序列发生重组02/28 21:37
24F：→ blence: 跟PCR不同,聚合欅在超长片段的突变,才会在nuclotide层次02/28 21:41
25F：→ blence: 所以对於viral vector只有透过PCR增减的片段才需要订序02/28 21:45
26F：→ blence: 单纯的transfrom只需要用酵素看切出的pattern即可02/28 21:47
27F：→ blence: 最好是用切出3~5片段的酵素组合,不适合只用单一切点观察02/28 21:49
28F：→ blence: 而且每次重新transform都要做,因为上面joseph提到的状况02/28 21:51
因为没做过这种 vector ,前段时间又卡在很基本的cloning……有点怕到 就直接送 seq了
下次我建立我会直接用 RE切来确认 ，谢谢 B大
※ 编辑: tynse71864 (223.136.213.163), 03/16/2018 09:18:46