作者syo0520 (SYO)
看板Biotech
標題[求救] Yeast two hybrid遇到複雜問題
時間Fri Feb 2 19:05:18 2018
版上各位先進好，
最近做yeast two hybrid遇到了一些問題想請教大家
因為想盡量詳述我的實驗條件 所以文章會有點長
敬請大家見諒!!!
我們用的是Hybrid Hunter kit
(AD的vector是帶有LexA的pHybLex/Zeo, BD則是帶有V5 epitope, NLS以及B42的pYESTrp)
用以分析幾個已知的植物蛋白是否有交互作用
遇到的第一個問題是,
每次transform之後都能在selection medium上得到30-50之間不等的single colony
(medium是YPD, Trp-/zeocin, 理論上只要兩個plasmid都有transform成功 菌就能在這個
盤子上長)
將這些colony挑起養到液態的medium (YPD, Trp-/zeocin)後 再同時點到YPD,
Trp-/zeocin medium及YPD, Trp-/His-/zeocin medium(兩plasmid所encode的外來蛋白如
果有interaction 就能在這個盤子上長)
在YPD, Trp-/zeocin沒有問題 所有的transformant都能長
但在YPD, Trp-/His-/zeocin medium, 來自同一個transformation盤子的不同colony 卻
有的會長 有的不會長
請問這種狀況很常見嗎?? 如果不常見的話 怎樣可以解決這問題呢??
又 該如何判定這兩個蛋白間是否有交互作用?
(我們目前是用”多數決”的方式 就是挑十來個colony 看是會長的多 還是不會長的多
來決定他們之間到底有沒有interaction
但這樣實在做得很心虛啊~~<囧>)
第二個問題
用上述方式確定了會interaction的蛋白
(這些蛋白皆非transcription factor, 而其中一部分蛋白已知有bind RNA的能力)
我們接著將他們fusion的蛋白交換
原本在pHybLex/Zeo上的基因換到pYESTrp
原本在pYESTrp上的基因換到pHybLex/Zeo
結果卻是原本會在YPD, Trp-/His-/zeocin medium長的變成不會長或是長得不好(要很濃
的菌液點下去才看得到 若稀釋就看不太到菌)
想知道為什麼會這樣?
老闆希望我能找到reference來解釋這個
但我可能是關鍵字都下得不好
找了一個禮拜都搜尋不到我要的結果
各廠牌的kit manual也找不到這些情形
(manual上的troubleshooting只說我的第二個問題可能是因為待測蛋白是transcription
factor 可我的不是啊 囧)
希望版上的高手們可以指引我一盞明燈
非常感激各位的幫忙!!! o>_<o
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1F：推 ad1980: 你的兩個 plasmids 各帶一個 nutritional marker，一個是 02/12 01:39
2F：→ ad1980: Zeo，一個是 Trp，如果可以在 -Trp/-Zeo 長，表示兩個都 02/12 01:39
3F：→ ad1980: 有轉進去，但不代表兩個有 interaction，你的 interaction 02/12 01:39
4F：→ ad1980: maker 是 His，能在 -His 上長的才表示有 interaction。 02/12 01:39
對 我用的系統是這樣
5F：推 ad1980: 你的 selection marker 只有 His 嗎？我之前做但用不同系 02/12 01:44
6F：→ ad1980: 統，有三層 selection marker，越來越 stringent，如果 in 02/12 01:44
7F：→ ad1980: teraction 夠強的話，到 medium stringent media 裡還是會 02/12 01:44
8F：→ ad1980: 長。 02/12 01:44
請問三層指的是??
除了缺乏His之外再加上測beta-glactosidase活性嗎?
還有一個是甚麼呢??
我有測beta-glactosidase活性
如果是用X-gal當substrate的話 只要是在-His/zeo培養基能長的
統統都會被染成藍色
但如果是用ONPG當substrate
所有transformant的訊號值都會比kit附的negative control還要低....
※ 編輯: syo0520 (42.76.174.48), 02/12/2018 17:31:39
※ 編輯: syo0520 (42.76.174.48), 02/12/2018 17:32:47