作者syo0520 (SYO)
看板Biotech
标题[求救] Yeast two hybrid遇到复杂问题
时间Fri Feb 2 19:05:18 2018
版上各位先进好，
最近做yeast two hybrid遇到了一些问题想请教大家
因为想尽量详述我的实验条件 所以文章会有点长
敬请大家见谅!!!
我们用的是Hybrid Hunter kit
(AD的vector是带有LexA的pHybLex/Zeo, BD则是带有V5 epitope, NLS以及B42的pYESTrp)
用以分析几个已知的植物蛋白是否有交互作用
遇到的第一个问题是,
每次transform之後都能在selection medium上得到30-50之间不等的single colony
(medium是YPD, Trp-/zeocin, 理论上只要两个plasmid都有transform成功 菌就能在这个
盘子上长)
将这些colony挑起养到液态的medium (YPD, Trp-/zeocin)後 再同时点到YPD,
Trp-/zeocin medium及YPD, Trp-/His-/zeocin medium(两plasmid所encode的外来蛋白如
果有interaction 就能在这个盘子上长)
在YPD, Trp-/zeocin没有问题 所有的transformant都能长
但在YPD, Trp-/His-/zeocin medium, 来自同一个transformation盘子的不同colony 却
有的会长 有的不会长
请问这种状况很常见吗?? 如果不常见的话 怎样可以解决这问题呢??
又 该如何判定这两个蛋白间是否有交互作用?
(我们目前是用”多数决”的方式 就是挑十来个colony 看是会长的多 还是不会长的多
来决定他们之间到底有没有interaction
但这样实在做得很心虚啊~~<囧>)
第二个问题
用上述方式确定了会interaction的蛋白
(这些蛋白皆非transcription factor, 而其中一部分蛋白已知有bind RNA的能力)
我们接着将他们fusion的蛋白交换
原本在pHybLex/Zeo上的基因换到pYESTrp
原本在pYESTrp上的基因换到pHybLex/Zeo
结果却是原本会在YPD, Trp-/His-/zeocin medium长的变成不会长或是长得不好(要很浓
的菌液点下去才看得到 若稀释就看不太到菌)
想知道为什麽会这样?
老板希望我能找到reference来解释这个
但我可能是关键字都下得不好
找了一个礼拜都搜寻不到我要的结果
各厂牌的kit manual也找不到这些情形
(manual上的troubleshooting只说我的第二个问题可能是因为待测蛋白是transcription
factor 可我的不是啊 囧)
希望版上的高手们可以指引我一盏明灯
非常感激各位的帮忙!!! o>_<o
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1F：推 ad1980: 你的两个 plasmids 各带一个 nutritional marker，一个是 02/12 01:39
2F：→ ad1980: Zeo，一个是 Trp，如果可以在 -Trp/-Zeo 长，表示两个都 02/12 01:39
3F：→ ad1980: 有转进去，但不代表两个有 interaction，你的 interaction 02/12 01:39
4F：→ ad1980: maker 是 His，能在 -His 上长的才表示有 interaction。 02/12 01:39
对 我用的系统是这样
5F：推 ad1980: 你的 selection marker 只有 His 吗？我之前做但用不同系 02/12 01:44
6F：→ ad1980: 统，有三层 selection marker，越来越 stringent，如果 in 02/12 01:44
7F：→ ad1980: teraction 够强的话，到 medium stringent media 里还是会 02/12 01:44
8F：→ ad1980: 长。 02/12 01:44
请问三层指的是??
除了缺乏His之外再加上测beta-glactosidase活性吗?
还有一个是甚麽呢??
我有测beta-glactosidase活性
如果是用X-gal当substrate的话 只要是在-His/zeo培养基能长的
统统都会被染成蓝色
但如果是用ONPG当substrate
所有transformant的讯号值都会比kit附的negative control还要低....
※ 编辑: syo0520 (42.76.174.48), 02/12/2018 17:31:39
※ 编辑: syo0520 (42.76.174.48), 02/12/2018 17:32:47