作者blence ( )
看板Biotech
標題[討論] Taqman gene expression assay
時間Mon Dec 11 21:47:47 2017
Taqman assay最常用的是FAM或VIC兩種螢光
對於同一個基因表現，不知道分別使用不同螢光探針上機
那麼獲得的CT會不會有所不同？
平常的實驗會把control跟target加入同一種螢光偵測
所以不會遇到上面的困擾
只是目前實驗會需要在一個tube中同時加入FAM或VIC去偵測target表現
而control就不確定只用FAM即可，或要同時加入VIC？
因為target_FAM或許可以從control_FAM計算deltaCT
但是target_VIC也跟著control_FAM去計算deltaCT的話，就覺得有些怪怪的
這問題詢問專員，回覆提到理論上CT不受螢光種類而有差異
不過實際上的有沒有影響，還是詢問一下有沒有人有相關經驗
謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 180.218.151.4
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1513000070.A.0FF.html
1F：推 qiet: 不同螢光強度當然有差 有差就可能影響單個樣品的Ct值，但理 12/12 19:56
Thermo的專員認為同一樣品，不同螢光的強度雖然有差，但CT應該會相同
不過沒data的話我是存疑
2F：→ qiet: 論上不影響不同樣品間的相對值，就像你用Sybr green測同一 12/12 19:56
3F：→ qiet: 個gene但用不同primer會有差異是差不多的 12/12 19:56
後面這兩句我看不懂
用貼近實驗的結果來做假設好了
在只放一對A gene primer的singleplex Taqman PCR reaction中
同時存在FAM與VIC兩種螢光probe用來偵測A gene表現，
CT的部分，A_FAM=20，A_VIC=22
而internal control，GAPDH_FAM=15，GAPDH_VIC則是我的問題
假使如原廠的推測GAPDH_VIC=15，與GAPDH_FAM沒有差異
那A的兩個螢光都只要跟GAPDH_FAM算相對值即可，不需要再多買GAPDH_VIC來混合
結論就是A_FAM的表現量比較多
但是萬一GAPDH_VIC=/=15，或有幾個CT的差異
那我的A_FAM與A_VIC就必須依照各別的螢光去算相對值
這時候前面的結論就不一定正確了
4F：推 supray: 只看ddCt還OK,因為是把control樣本當1去做normalize， 12/13 00:10
5F：→ supray: 如1樓所說，比較的是不同樣本的表現量 12/13 00:11
6F：→ supray: 但你的比較方式就有點問題，只取dCt 12/13 00:12
7F：→ supray: 不同primer或不同probe，最好是要當成不同的target 12/13 00:14
8F：→ supray: 因為primer濃度，螢光強弱，threshold的值都會影響Ct 12/13 00:15
9F：→ supray: 在同個樣本間無法比較 12/13 00:16
我的最終目的當然是要比較ddCT
上面只是先聚焦在只有一個樣本時，
A_FAM, A_VIC與GAPDH_FAM的相對量該如何比較
如果無法凸顯同一樣本內的A_FAM與A_VIC有所不同
自然就無法從接續往後不同樣本的實驗設計
如果我的理解沒錯
目前看起來就算是同一樣本,primer,濃度,實驗條件....種種因素都相同的情況下
上面兩位都認為改變不同的probe螢光,就會導致CT值改變的樣子
※ 編輯: blence (180.218.151.4), 12/13/2017 01:36:20
10F：→ supray: 那就需要有一個確定是A_FAM,A_VIC target 1:1的樣本 12/13 01:25
11F：→ supray: 當作是你的標準品 12/13 01:25
※ 編輯: blence (180.218.151.4), 12/13/2017 01:41:16
12F：→ Invec: 將該片段進行TA cloning作為標準品 每次上機做絕對定量即可 12/14 13:27
13F：→ Invec: 標準曲線需分螢光做 12/14 13:29