作者blence ( )
看板Biotech
标题[讨论] Taqman gene expression assay
时间Mon Dec 11 21:47:47 2017
Taqman assay最常用的是FAM或VIC两种萤光
对於同一个基因表现，不知道分别使用不同萤光探针上机
那麽获得的CT会不会有所不同？
平常的实验会把control跟target加入同一种萤光侦测
所以不会遇到上面的困扰
只是目前实验会需要在一个tube中同时加入FAM或VIC去侦测target表现
而control就不确定只用FAM即可，或要同时加入VIC？
因为target_FAM或许可以从control_FAM计算deltaCT
但是target_VIC也跟着control_FAM去计算deltaCT的话，就觉得有些怪怪的
这问题询问专员，回覆提到理论上CT不受萤光种类而有差异
不过实际上的有没有影响，还是询问一下有没有人有相关经验
谢谢
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1F：推 qiet: 不同萤光强度当然有差 有差就可能影响单个样品的Ct值，但理 12/12 19:56
Thermo的专员认为同一样品，不同萤光的强度虽然有差，但CT应该会相同
不过没data的话我是存疑
2F：→ qiet: 论上不影响不同样品间的相对值，就像你用Sybr green测同一 12/12 19:56
3F：→ qiet: 个gene但用不同primer会有差异是差不多的 12/12 19:56
後面这两句我看不懂
用贴近实验的结果来做假设好了
在只放一对A gene primer的singleplex Taqman PCR reaction中
同时存在FAM与VIC两种萤光probe用来侦测A gene表现，
CT的部分，A_FAM=20，A_VIC=22
而internal control，GAPDH_FAM=15，GAPDH_VIC则是我的问题
假使如原厂的推测GAPDH_VIC=15，与GAPDH_FAM没有差异
那A的两个萤光都只要跟GAPDH_FAM算相对值即可，不需要再多买GAPDH_VIC来混合
结论就是A_FAM的表现量比较多
但是万一GAPDH_VIC=/=15，或有几个CT的差异
那我的A_FAM与A_VIC就必须依照各别的萤光去算相对值
这时候前面的结论就不一定正确了
4F：推 supray: 只看ddCt还OK,因为是把control样本当1去做normalize， 12/13 00:10
5F：→ supray: 如1楼所说，比较的是不同样本的表现量 12/13 00:11
6F：→ supray: 但你的比较方式就有点问题，只取dCt 12/13 00:12
7F：→ supray: 不同primer或不同probe，最好是要当成不同的target 12/13 00:14
8F：→ supray: 因为primer浓度，萤光强弱，threshold的值都会影响Ct 12/13 00:15
9F：→ supray: 在同个样本间无法比较 12/13 00:16
我的最终目的当然是要比较ddCT
上面只是先聚焦在只有一个样本时，
A_FAM, A_VIC与GAPDH_FAM的相对量该如何比较
如果无法凸显同一样本内的A_FAM与A_VIC有所不同
自然就无法从接续往後不同样本的实验设计
如果我的理解没错
目前看起来就算是同一样本,primer,浓度,实验条件....种种因素都相同的情况下
上面两位都认为改变不同的probe萤光,就会导致CT值改变的样子
※ 编辑: blence (180.218.151.4), 12/13/2017 01:36:20
10F：→ supray: 那就需要有一个确定是A_FAM,A_VIC target 1:1的样本 12/13 01:25
11F：→ supray: 当作是你的标准品 12/13 01:25
※ 编辑: blence (180.218.151.4), 12/13/2017 01:41:16
12F：→ Invec: 将该片段进行TA cloning作为标准品 每次上机做绝对定量即可 12/14 13:27
13F：→ Invec: 标准曲线需分萤光做 12/14 13:29