作者dasiy3112001 (~讓我考上吧~)
看板Biotech
標題[求救] WBㄧ直壓出白白ㄧ片
時間Sat Nov 18 17:40:14 2017
https://i.imgur.com/iTNqMch.jpg
最近WB壓片結果ㄧ直像上圖ㄧ樣。
上膠: 60V 40~50min
下膠:90-100V
-
-transfer:100V 90min
blocking:1hr
1抗 O/N
0.05%TBST wash*4共40min
2抗 1hr
0.05%TBST wash*4共40min
之後ECL就去壓片。
之前用同樣條件都壓的出來,
近期不知道發生什麼事就ㄧ直重覆ㄧ樣的失敗!
我的10X running配方如下圖
https://i.imgur.com/4UbzNJp.jpg
已經ㄧ個星期沒進度了，拜託大家幫我看看哪裡出問題了。
謝謝大家
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 114.34.144.193
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1510998017.A.089.html
1F：推 joseph103331: 這時候你需要Positive control, 之前有沒有留樣本? 11/18 17:41
2F：→ joseph103331: 把之前的樣本配合現在的再跑一次, 若還是沒有, 抗體 11/18 17:43
3F：→ joseph103331: 出問題的可能性較大 11/18 17:43
4F：→ e104582001: 個人不認為一抗有問題，感覺應該是有用不同一抗 11/18 18:07
5F：→ e104582001: ECL壞的機率比較小，試試看換換2抗? 11/18 18:08
6F：→ e104582001: 膠也有可能有出問題，這都要去試試看才知道 11/18 18:09
7F：→ e104582001: 從右下的圖來看可能是跑完膠就有問題了 11/18 18:10
8F：→ e104582001: 轉染之後染看看 ponceau S Y 11/18 18:10
9F：→ e104582001: 若是真的懷疑buffer有問題就先重配個1L的1X running 11/18 18:12
10F：→ e104582001: buffer 跑看看就知道了 11/18 18:12
11F：推 isdorothy: 你的actin也這樣嗎 11/18 22:34
12F：推 tynse71864: 需要 positive Ctrl 不然可能性太多了捏 11/19 00:10
13F：→ dasiy3112001: actin也ㄧ樣這樣，所以才覺得很怪！ 11/19 08:59
14F：推 MDCCLXXVI: Marker有transfer ok嗎？ 11/19 10:16
15F：→ osla30: running的glycine 144g為什麼要劃掉？ 11/19 12:10
16F：推 as862437: transfer 的buffer有更新嗎？用太多次轉印效率會變差 11/19 12:44
17F：→ dasiy3112001: Marker每次都有的轉過去，transfer buffer用reuse 11/19 13:35
18F：→ dasiy3112001: 的我也都會加至少ㄧ半全新的ㄧ起用。running配方我 11/19 13:35
19F：→ dasiy3112001: 也覺得有問題 11/19 13:35
20F：→ blence: runngin buffer這裡,有人用144g,也有用192g,都跟你寫不同 11/19 15:43
21F：→ blence: 文章先說marker有跑開,就比較好猜測跟running無關 11/19 15:45
22F：→ blence: 另外transfer每次都是半新半舊,應該很少人這麼用吧？ 11/19 15:45
23F：推 joseph103331: Transfer我們都可以用到8次,每次1~1.5hr還是可以做 11/19 16:11
24F：→ bj59420: transfer buffer全部重配呢？不要用舊的試試看 11/19 21:30
25F：→ bj59420: 之前實驗室發生過marker過去但也壓不出東西，換人配buffe 11/19 21:31
26F：→ bj59420: r就沒事了 11/19 21:31
27F：→ dasiy3112001: 好，我已重配了！謝謝大家 11/20 15:24
28F：推 sonny77: Transfer buffer重配 可能有配錯 11/20 18:53
29F：推 michealking: 膠染一下就知道啦 11/20 23:07
30F：推 untilnow: 你加完ecl到壓片多久？1/2抗品牌和濃度？ 11/22 01:21
31F：→ dasiy3112001: 謝謝大家，結果發現是二抗壞掉，感謝大家提供可能 11/22 19:30
32F：→ dasiy3112001: 的錯誤資訊，謝謝。 11/22 19:30
33F：推 charliedorae: 二抗可重配 03/27 23:46