作者dasiy3112001 (~让我考上吧~)
看板Biotech
标题[求救] WBㄧ直压出白白ㄧ片
时间Sat Nov 18 17:40:14 2017
https://i.imgur.com/iTNqMch.jpg
最近WB压片结果ㄧ直像上图ㄧ样。
上胶: 60V 40~50min
下胶:90-100V
-
-transfer:100V 90min
blocking:1hr
1抗 O/N
0.05%TBST wash*4共40min
2抗 1hr
0.05%TBST wash*4共40min
之後ECL就去压片。
之前用同样条件都压的出来,
近期不知道发生什麽事就ㄧ直重覆ㄧ样的失败!
我的10X running配方如下图
https://i.imgur.com/4UbzNJp.jpg
已经ㄧ个星期没进度了，拜托大家帮我看看哪里出问题了。
谢谢大家
--
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1F：推 joseph103331: 这时候你需要Positive control, 之前有没有留样本? 11/18 17:41
2F：→ joseph103331: 把之前的样本配合现在的再跑一次, 若还是没有, 抗体 11/18 17:43
3F：→ joseph103331: 出问题的可能性较大 11/18 17:43
4F：→ e104582001: 个人不认为一抗有问题，感觉应该是有用不同一抗 11/18 18:07
5F：→ e104582001: ECL坏的机率比较小，试试看换换2抗? 11/18 18:08
6F：→ e104582001: 胶也有可能有出问题，这都要去试试看才知道 11/18 18:09
7F：→ e104582001: 从右下的图来看可能是跑完胶就有问题了 11/18 18:10
8F：→ e104582001: 转染之後染看看 ponceau S Y 11/18 18:10
9F：→ e104582001: 若是真的怀疑buffer有问题就先重配个1L的1X running 11/18 18:12
10F：→ e104582001: buffer 跑看看就知道了 11/18 18:12
11F：推 isdorothy: 你的actin也这样吗 11/18 22:34
12F：推 tynse71864: 需要 positive Ctrl 不然可能性太多了捏 11/19 00:10
13F：→ dasiy3112001: actin也ㄧ样这样，所以才觉得很怪！ 11/19 08:59
14F：推 MDCCLXXVI: Marker有transfer ok吗？ 11/19 10:16
15F：→ osla30: running的glycine 144g为什麽要划掉？ 11/19 12:10
16F：推 as862437: transfer 的buffer有更新吗？用太多次转印效率会变差 11/19 12:44
17F：→ dasiy3112001: Marker每次都有的转过去，transfer buffer用reuse 11/19 13:35
18F：→ dasiy3112001: 的我也都会加至少ㄧ半全新的ㄧ起用。running配方我 11/19 13:35
19F：→ dasiy3112001: 也觉得有问题 11/19 13:35
20F：→ blence: runngin buffer这里,有人用144g,也有用192g,都跟你写不同 11/19 15:43
21F：→ blence: 文章先说marker有跑开,就比较好猜测跟running无关 11/19 15:45
22F：→ blence: 另外transfer每次都是半新半旧,应该很少人这麽用吧？ 11/19 15:45
23F：推 joseph103331: Transfer我们都可以用到8次,每次1~1.5hr还是可以做 11/19 16:11
24F：→ bj59420: transfer buffer全部重配呢？不要用旧的试试看 11/19 21:30
25F：→ bj59420: 之前实验室发生过marker过去但也压不出东西，换人配buffe 11/19 21:31
26F：→ bj59420: r就没事了 11/19 21:31
27F：→ dasiy3112001: 好，我已重配了！谢谢大家 11/20 15:24
28F：推 sonny77: Transfer buffer重配 可能有配错 11/20 18:53
29F：推 michealking: 胶染一下就知道啦 11/20 23:07
30F：推 untilnow: 你加完ecl到压片多久？1/2抗品牌和浓度？ 11/22 01:21
31F：→ dasiy3112001: 谢谢大家，结果发现是二抗坏掉，感谢大家提供可能 11/22 19:30
32F：→ dasiy3112001: 的错误资讯，谢谢。 11/22 19:30
33F：推 charliedorae: 二抗可重配 03/27 23:46