作者ernielwl (ernielwl)
看板Biotech
標題[求救] TA cloning錯誤insert請教
時間Tue Oct 3 14:04:59 2017
請教經驗豐富的各位
做TA cloning會常常挑到錯誤的insert嗎
小弟使用RBC TA cloning kit
inserts 大小為1.5k，PCR產物經過gel extraction 純化
按照protocol 操作，ligation,transform結果都很好
但是藍白篩挑的白色菌落常常有錯誤insert
(藍白篩效果也沒有不好)
https://i.imgur.com/JfhE8nL.jpg
我們lab是從藍白篩挑白色菌起來，先在固態ampicillin LB做一次純培養，再到液體ampi
cillin LB隔夜
之後用Geneaid mini plasmid kit抽質體
質體由HindIII在37度切30min後跑電泳確認inserts
附上vector map
https://i.imgur.com/MEulSGM.jpg
確定HindIII有兩個site可以切下中間的insert
然後切過的質體，常常在500bp,1kb跑出兩個產物，如附圖，34567跑道，第8跑道先前做
好的，正確的對照組
(marker使用100bp plus Dna ladder)
https://i.imgur.com/SHhjYE0.jpg
一開始老師以為那可能是insert裡面有HindIII切位，500bp+1k剛好是1.5kb
但是我在基因序列上分析過並沒有HindIII切位
還是有送其中一個sample去定序，
回來的結果經過blastn得到的都是一些vector
https://i.imgur.com/hEi56BK.jpg
小弟實在不了解，會產生這些錯誤insert的原因是什麼? 是TA vector自己產生奇怪的自
接嗎？
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 101.8.211.165
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※ 編輯: ernielwl (101.8.211.165), 10/03/2017 14:07:02
※ 編輯: ernielwl (101.8.211.165), 10/03/2017 14:10:11
1F：→ xxtomnyxx: 我會用 M13 forward 和 M13 reverse 去做 colony PCR10/03 15:00
2F：→ xxtomnyxx: 有可能是 vector 有 contamination10/03 15:02
我們lab不習慣從colony PCR，boss說會有偽陽性，最後質體還是會抽，用質體出來跑是
最準的
然後我用M13 forward 分別我Insert的 forward, reverse primer去PCR確認，不然M13 F
,R跑出來大小還是一樣1.5kb分不清處
※ 編輯: ernielwl (101.8.211.165), 10/03/2017 15:08:39
3F：→ blence: 約1.5k這一段,跟起始作為PCR template也沒有關係嗎？10/03 18:15
前陣子做insert只有400~700bp的時候也會出現這段
這次剛好clone 1.5kb的產物所以有一起去定序，真的一點關係都沒有
非常詭異......而且跟vector的序列去alignment也不是100%對到其中一段
4F：推 rebirth: 先colony PCR screening,挑出對的size insert10/03 19:03
5F：→ rebirth: 再抽plasmid做 RE check10/03 19:04
我們跳過colony PCR直接繼續下去RE check，結果來說其實一樣，做起來習慣就好
※ 編輯: ernielwl (175.96.64.191), 10/03/2017 19:25:51
6F：推 lail: 會耶，之前做TA多少會跳到奇怪的clone(定序結果)，所以除非10/03 20:46
7F：→ lail: 不得已，不然不太用TA cloning10/03 20:46
8F：推 milkpa: lane2/345/67/8 ，總共有四種pattern，各拿一個去定序 10/03 20:59
9F：→ xxtomnyxx: 我會猜你們的 TA vector 可能混到其他不知名的 vector10/03 21:03
Vector都是新買的，每次做都多少會這樣......
10F：推 rebirth: TA vector不加insert直接transform看看？看看有沒有污染10/03 21:10
直接加還是做一個no inserts的ligation controls? 如果測出有問題那這家公司的vecto
r品質堪憂QQ
※ 編輯: ernielwl (175.96.64.191), 10/03/2017 22:11:40
11F：推 rebirth: 或許兩種都該試試，天曉得是DNA fragment還是plasmid 10/03 23:22
12F：→ rebirth: contamination10/03 23:23
13F：→ Sylvaine: 有考慮用其他re切切看嗎？還有，能請教你們用什麼做為t10/04 20:17
其他RE切沒什麼意義，從一開始挑起來的clone裡面insert就錯了
14F：→ Sylvaine: emplate嗎？10/04 20:17
insert是由cDNA為template PCR出來的，內文有說，會經過一次切膠純化，所以片段大小
不會出錯
※ 編輯: ernielwl (175.96.64.191), 10/04/2017 21:55:58
15F：→ blence: 從你放的blast來看,好像是訂序到backbone,也就是pUC19序列10/04 22:40
16F：→ blence: 這1+0.5k不是塞到TA之間,所以應該不是insert污染 10/04 22:41
17F：→ blence: 跑個uncut看有insert的比vector only,或許可以看到雜band 10/04 22:43
18F：→ blence: 只是這是vector或來自Ecoli的污染,要測過才知道 10/04 22:47
19F：→ blence: 我們曾經遇過Ecoli有plasmid污染,就是他們的HIT DH5a10/04 22:51
原來如此，看來他們的 HIT DH5a也可能有問題......
不過我也有用他們這組competent cell 裡面附的 control plasmid，transform出來全部
都是藍色菌落，如果污染到應該也會混白色的
目前推測TA vector裡面污染的可能性比較高
謝謝大家給的建議與回覆!
※ 編輯: ernielwl (175.96.64.191), 10/04/2017 23:46:23