作者ernielwl (ernielwl)
看板Biotech
标题[求救] TA cloning错误insert请教
时间Tue Oct 3 14:04:59 2017
请教经验丰富的各位
做TA cloning会常常挑到错误的insert吗
小弟使用RBC TA cloning kit
inserts 大小为1.5k，PCR产物经过gel extraction 纯化
按照protocol 操作，ligation,transform结果都很好
但是蓝白筛挑的白色菌落常常有错误insert
(蓝白筛效果也没有不好)
https://i.imgur.com/JfhE8nL.jpg
我们lab是从蓝白筛挑白色菌起来，先在固态ampicillin LB做一次纯培养，再到液体ampi
cillin LB隔夜
之後用Geneaid mini plasmid kit抽质体
质体由HindIII在37度切30min後跑电泳确认inserts
附上vector map
https://i.imgur.com/MEulSGM.jpg
确定HindIII有两个site可以切下中间的insert
然後切过的质体，常常在500bp,1kb跑出两个产物，如附图，34567跑道，第8跑道先前做
好的，正确的对照组
(marker使用100bp plus Dna ladder)
https://i.imgur.com/SHhjYE0.jpg
一开始老师以为那可能是insert里面有HindIII切位，500bp+1k刚好是1.5kb
但是我在基因序列上分析过并没有HindIII切位
还是有送其中一个sample去定序，
回来的结果经过blastn得到的都是一些vector
https://i.imgur.com/hEi56BK.jpg
小弟实在不了解，会产生这些错误insert的原因是什麽? 是TA vector自己产生奇怪的自
接吗？
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※ 编辑: ernielwl (101.8.211.165), 10/03/2017 14:07:02
※ 编辑: ernielwl (101.8.211.165), 10/03/2017 14:10:11
1F：→ xxtomnyxx: 我会用 M13 forward 和 M13 reverse 去做 colony PCR10/03 15:00
2F：→ xxtomnyxx: 有可能是 vector 有 contamination10/03 15:02
我们lab不习惯从colony PCR，boss说会有伪阳性，最後质体还是会抽，用质体出来跑是
最准的
然後我用M13 forward 分别我Insert的 forward, reverse primer去PCR确认，不然M13 F
,R跑出来大小还是一样1.5kb分不清处
※ 编辑: ernielwl (101.8.211.165), 10/03/2017 15:08:39
3F：→ blence: 约1.5k这一段,跟起始作为PCR template也没有关系吗？10/03 18:15
前阵子做insert只有400~700bp的时候也会出现这段
这次刚好clone 1.5kb的产物所以有一起去定序，真的一点关系都没有
非常诡异......而且跟vector的序列去alignment也不是100%对到其中一段
4F：推 rebirth: 先colony PCR screening,挑出对的size insert10/03 19:03
5F：→ rebirth: 再抽plasmid做 RE check10/03 19:04
我们跳过colony PCR直接继续下去RE check，结果来说其实一样，做起来习惯就好
※ 编辑: ernielwl (175.96.64.191), 10/03/2017 19:25:51
6F：推 lail: 会耶，之前做TA多少会跳到奇怪的clone(定序结果)，所以除非10/03 20:46
7F：→ lail: 不得已，不然不太用TA cloning10/03 20:46
8F：推 milkpa: lane2/345/67/8 ，总共有四种pattern，各拿一个去定序 10/03 20:59
9F：→ xxtomnyxx: 我会猜你们的 TA vector 可能混到其他不知名的 vector10/03 21:03
Vector都是新买的，每次做都多少会这样......
10F：推 rebirth: TA vector不加insert直接transform看看？看看有没有污染10/03 21:10
直接加还是做一个no inserts的ligation controls? 如果测出有问题那这家公司的vecto
r品质堪忧QQ
※ 编辑: ernielwl (175.96.64.191), 10/03/2017 22:11:40
11F：推 rebirth: 或许两种都该试试，天晓得是DNA fragment还是plasmid 10/03 23:22
12F：→ rebirth: contamination10/03 23:23
13F：→ Sylvaine: 有考虑用其他re切切看吗？还有，能请教你们用什麽做为t10/04 20:17
其他RE切没什麽意义，从一开始挑起来的clone里面insert就错了
14F：→ Sylvaine: emplate吗？10/04 20:17
insert是由cDNA为template PCR出来的，内文有说，会经过一次切胶纯化，所以片段大小
不会出错
※ 编辑: ernielwl (175.96.64.191), 10/04/2017 21:55:58
15F：→ blence: 从你放的blast来看,好像是订序到backbone,也就是pUC19序列10/04 22:40
16F：→ blence: 这1+0.5k不是塞到TA之间,所以应该不是insert污染 10/04 22:41
17F：→ blence: 跑个uncut看有insert的比vector only,或许可以看到杂band 10/04 22:43
18F：→ blence: 只是这是vector或来自Ecoli的污染,要测过才知道 10/04 22:47
19F：→ blence: 我们曾经遇过Ecoli有plasmid污染,就是他们的HIT DH5a10/04 22:51
原来如此，看来他们的 HIT DH5a也可能有问题......
不过我也有用他们这组competent cell 里面附的 control plasmid，transform出来全部
都是蓝色菌落，如果污染到应该也会混白色的
目前推测TA vector里面污染的可能性比较高
谢谢大家给的建议与回覆!
※ 编辑: ernielwl (175.96.64.191), 10/04/2017 23:46:23