作者tanya1993 (幫幫)
看板Biotech
標題[求救] 限制酶切不了
時間Tue Jul 11 17:22:17 2017
這是我所設計的primer
F-primer
5'GCGGCCGCATGTGTCGGTACTTGAAG3'
R-primer
5'GGATCCTTATCTTGGATGAGCGAC3'
使用的是NotI和BamHI
在重組的部分，已經有成功接上T vector,也送到DH5a裡面，經過PCR確認後也有目標基因
。但是之後想切下目標基因後，發現完全切不下來。
這是我用的條件
50uL plasmid +各1uL enzyme +2uL 3.1buffer 放4小時
50uL plasmid +各2uL enzyme +5uL 3.1buffer 放8小時
皆在37度
試過後發現都無法切下。
查過資料後，在想說會不會是DH5a跟NotI有甲基化的關係!?!?!也只是猜想而已。
請問各位，可以問問是我哪邊出問題嗎？
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1F：推 joseph103331: 我是在想 你的primer前面怎麼沒有多幾個bp? 07/11 17:46
2F：→ joseph103331: 這樣能切嗎? 然後我去google T vector,查到pGEM-T 07/11 17:47
3F：→ joseph103331: 可是上面沒有BamHI阿... 07/11 17:47
4F：→ lail: 單獨切試試? 07/11 17:52
5F：→ lail: 然後定序，看一下enzyme site是不是正確 07/11 17:53
6F：推 ampicillin: NotI前面不加mer是切不下來的喔 (NEB說的) 07/11 18:32
8F：推 ampicillin: 啊我目小沒看到TA cloning 07/11 18:42
9F：→ xxtomnyxx: 推定序，另外確認下你的酵素是不是 HF 版本的 07/11 18:44
10F：→ ganbaba: 試試用TA附的F&R primer p出來再切然後接到你的載體吧 07/11 18:52
11F：推 Ianthegood: 兩個都沒切嗎?還有沒有supercoil的plasmid? 07/11 19:04
12F：→ blence: 看到3.1buffer的用法,會讓人覺得整組實驗有問題 07/11 19:08
13F：→ xxtomnyxx: 欸等等！？你不是把總體積補到 50？是直接下50 uL 的 07/11 20:53
14F：→ xxtomnyxx: plasmid 下去？ 07/11 20:53
15F：推 tynse71864: 2ul會不會太多@@ 07/11 21:25
16F：→ tynse71864: enzyme 07/11 21:25
17F：推 ampicillin: 但咧，你那個buffer體積怎麼...不是1/10? 07/11 21:54
18F：→ tanya1993: blence 我是用NEB double digest finder 去查他倆的最 07/12 00:04
19F：→ tanya1993: 佳buffer的，還是要用哪個比較妥當嗎？ 07/12 00:04
20F：→ tanya1993: xxtomnyxx 因為想要大量切膠回收，所以就把抽到的質體 07/12 00:06
21F：→ tanya1993: 直接全切下去，我第二組條件就有把buffer用1/10的比例 07/12 00:06
22F：→ tanya1993: 下去了 07/12 00:06
23F：→ tanya1993: 今天有嘗試分別切切看了，決定先放overnight看看 07/12 00:12
24F：→ tanya1993: ampicillin 想問一下，因為是初次接觸重組基因這塊， 07/12 00:17
25F：→ tanya1993: 當初在設計primer，我其實還未了解限制酶前面要多加mer 07/12 00:17
26F：→ tanya1993: 這觀念，因為看之前學長都沒有加而且有順利切下，所以 07/12 00:17
27F：→ tanya1993: 覺得沒有影響。那請問是因為有Tvector的關係所以才不 07/12 00:17
28F：→ tanya1993: 用額外加其他mer嗎？ 07/12 00:17
29F：→ blence: 第二次,如果50ul是plasmid體積量,那還是不符合1/10 07/12 00:19
30F：→ blence: 第一次的digest如果不是錯字,基本上不該出現這的做法的 07/12 00:21
31F：→ blence: 會採用不符合1/10的操作,暗示整個cloning過程會有未知錯誤 07/12 00:24
32F：→ blence: RE site後面多加mer的部分,因為你用TA,這不需要煩惱 07/12 00:25
33F：→ blence: 反而是為了配合TA而用Taq時,未訂序直接往後做怕會有mutant 07/12 00:28
34F：→ blence: 還有就是老問題了,文中標示總量或濃度比較能看出問題, 07/12 00:29
35F：→ blence: 而不是體積;另外cloning的試劑,有廠牌訊息也方便辨識 07/12 00:31
36F：→ blence: 還有><,你查到的NotI只對CpG敏感,用DH5a完全不用擔心這個 07/12 00:33
37F：→ lail: 其實切得動的話，放1小時就會切了，不需要到O/N，尤其你又只 07/12 07:34
38F：→ lail: 是要測試而已 07/12 07:34
39F：→ huuban: 有沒有測濃度啊?會不會太濃了然後buffer量又不對? 07/12 23:52