作者tanya1993 (帮帮)
看板Biotech
标题[求救] 限制酶切不了
时间Tue Jul 11 17:22:17 2017
这是我所设计的primer
F-primer
5'GCGGCCGCATGTGTCGGTACTTGAAG3'
R-primer
5'GGATCCTTATCTTGGATGAGCGAC3'
使用的是NotI和BamHI
在重组的部分，已经有成功接上T vector,也送到DH5a里面，经过PCR确认後也有目标基因
。但是之後想切下目标基因後，发现完全切不下来。
这是我用的条件
50uL plasmid +各1uL enzyme +2uL 3.1buffer 放4小时
50uL plasmid +各2uL enzyme +5uL 3.1buffer 放8小时
皆在37度
试过後发现都无法切下。
查过资料後，在想说会不会是DH5a跟NotI有甲基化的关系!?!?!也只是猜想而已。
请问各位，可以问问是我哪边出问题吗？
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1F：推 joseph103331: 我是在想 你的primer前面怎麽没有多几个bp? 07/11 17:46
2F：→ joseph103331: 这样能切吗? 然後我去google T vector,查到pGEM-T 07/11 17:47
3F：→ joseph103331: 可是上面没有BamHI阿... 07/11 17:47
4F：→ lail: 单独切试试? 07/11 17:52
5F：→ lail: 然後定序，看一下enzyme site是不是正确 07/11 17:53
6F：推 ampicillin: NotI前面不加mer是切不下来的喔 (NEB说的) 07/11 18:32
8F：推 ampicillin: 啊我目小没看到TA cloning 07/11 18:42
9F：→ xxtomnyxx: 推定序，另外确认下你的酵素是不是 HF 版本的 07/11 18:44
10F：→ ganbaba: 试试用TA附的F&R primer p出来再切然後接到你的载体吧 07/11 18:52
11F：推 Ianthegood: 两个都没切吗?还有没有supercoil的plasmid? 07/11 19:04
12F：→ blence: 看到3.1buffer的用法,会让人觉得整组实验有问题 07/11 19:08
13F：→ xxtomnyxx: 欸等等！？你不是把总体积补到 50？是直接下50 uL 的 07/11 20:53
14F：→ xxtomnyxx: plasmid 下去？ 07/11 20:53
15F：推 tynse71864: 2ul会不会太多@@ 07/11 21:25
16F：→ tynse71864: enzyme 07/11 21:25
17F：推 ampicillin: 但咧，你那个buffer体积怎麽...不是1/10? 07/11 21:54
18F：→ tanya1993: blence 我是用NEB double digest finder 去查他俩的最 07/12 00:04
19F：→ tanya1993: 佳buffer的，还是要用哪个比较妥当吗？ 07/12 00:04
20F：→ tanya1993: xxtomnyxx 因为想要大量切胶回收，所以就把抽到的质体 07/12 00:06
21F：→ tanya1993: 直接全切下去，我第二组条件就有把buffer用1/10的比例 07/12 00:06
22F：→ tanya1993: 下去了 07/12 00:06
23F：→ tanya1993: 今天有尝试分别切切看了，决定先放overnight看看 07/12 00:12
24F：→ tanya1993: ampicillin 想问一下，因为是初次接触重组基因这块， 07/12 00:17
25F：→ tanya1993: 当初在设计primer，我其实还未了解限制酶前面要多加mer 07/12 00:17
26F：→ tanya1993: 这观念，因为看之前学长都没有加而且有顺利切下，所以 07/12 00:17
27F：→ tanya1993: 觉得没有影响。那请问是因为有Tvector的关系所以才不 07/12 00:17
28F：→ tanya1993: 用额外加其他mer吗？ 07/12 00:17
29F：→ blence: 第二次,如果50ul是plasmid体积量,那还是不符合1/10 07/12 00:19
30F：→ blence: 第一次的digest如果不是错字,基本上不该出现这的做法的 07/12 00:21
31F：→ blence: 会采用不符合1/10的操作,暗示整个cloning过程会有未知错误 07/12 00:24
32F：→ blence: RE site後面多加mer的部分,因为你用TA,这不需要烦恼 07/12 00:25
33F：→ blence: 反而是为了配合TA而用Taq时,未订序直接往後做怕会有mutant 07/12 00:28
34F：→ blence: 还有就是老问题了,文中标示总量或浓度比较能看出问题, 07/12 00:29
35F：→ blence: 而不是体积;另外cloning的试剂,有厂牌讯息也方便辨识 07/12 00:31
36F：→ blence: 还有><,你查到的NotI只对CpG敏感,用DH5a完全不用担心这个 07/12 00:33
37F：→ lail: 其实切得动的话，放1小时就会切了，不需要到O/N，尤其你又只 07/12 07:34
38F：→ lail: 是要测试而已 07/12 07:34
39F：→ huuban: 有没有测浓度啊?会不会太浓了然後buffer量又不对? 07/12 23:52