作者aaaazzzz (找英文家教)
看板Biotech
標題Re: [求救] WB strip strip可信度
時間Fri Apr 28 17:29:48 2017
※ 引述《k60351p (misakilin)》之銘言：
: 想問一下版上的前輩們
: 我最近在跑WB
: 想看某個KINASE的磷酸化
: 依照別人的建議是先壓PHOSPHO
: 再壓TOTAL
: 但第一次結果出來磷酸化的確有改變趨勢
: 但是TOTAL的部分也有改變的現象
: 不確定是否是strip所造成的誤差還是什麼?
: （internal control沒問題，抗體是abcam，commercial stripping buffer）
: 想問phospho跟total在同一個位子
: 用strip壓是否有可信度的問題?
: （sample量有點多，如果都要跑二重覆會有加不完的班。。。）
phospho protein strip之後的membrane，是否會影響total的量，
要看是哪一種protein，
如果phospho比例佔得很高，
strip之後確實會造成total量的改變，
但事實上沒有人可以預知phospho佔的比例有多高，
所以保險起見，我的作法是第一次的實驗同時跑兩片，
一片跑phospho-protein，第二片跑total protein，
隔天phospho-protein strip掉之後，
重新上一次total protein的抗體，
看看是否會跟單純跑total protein的結果一致，
如果一致，之後第二、三...重複就直接把phospho strip掉，然後壓total，
如果phospho影響到total的表現，那只好分兩片跑，
以上是我的作法，缺點是非常耗時，
每次新條件的測試都得花上比別人多一倍的時間，
全實驗室好像也只有我會這樣做(好處當然是得到的實驗結果比較容易再現)，
實際上因為這類的主題通常著重在phospho的改變，
如果希望得到total protein視覺上沒有改變，
把曝光時間拉長，total protein看起來差異就不會太大，
所以一般助理與碩班學生普遍的做法就直接strip掉，
然後讓total protein改變不要太大。
(除非phospho比例真的很大，磷酸化與一般抗體會競爭，
或者研究的主題是要看到protein在細胞空間的改變)
另外，分兩片跑也有它的缺點，
因為使用了兩片不同的internal control，
所以前提是Western blotting技術要熟練，定量要準確，跑起來的band都要很一致，
否則老師如果看到phospho或者total protein改變來自於internal control不同，
應該會很不開心，
(還有的缺點就是比較picky的reviewer可能要求在同一片，
不過我丟的雜誌比較低分，是還沒遇到要看原始data的reviewer)
對於剛做實驗的碩班生，如果研究的phospho protein占很大的比例，
這的確是死穴(因跑同一片會影響，跑不同片每次internal control定量又不一致)
只能找有經驗的學長姊幫忙，
最重要的是實驗的結果大家都能夠reproducible
: 另外想問，如果壓出來的band偏淡，而且背景較深，是應該調二抗還是一抗的比例?還是應該調整blocking的方式
: （5%skim milk blocking ,santa cruz 的抗體（非磷酸化），一抗 1:500 二抗1:5000）
: 麻煩大家給我一點意見，謝謝
如果您的問題是針對剛剛phospho/total延伸，
我會提高一抗的比例，
如果單獨壓protein 一抗使用1:1000可得到好的視覺效果，
那strip之後的膜會把一抗抗體濃度提高到1:800以上，
二抗維持不變(二抗跟廠牌有關連性，某些廠牌濃度太高背景會變很髒)，
如果僅是針對一般的band沒有表現，
一般會建議找個positive control，
(實際上要拿到會表現此protein的cell line也不容易)，
至於表現band微弱且背景深這原因就多囉，
band偏淡，解決方法包含提高protein的量/提高一抗/換別家抗體....
背景深，解決方法包含降低二抗/換別家抗體/增加wash時間或者擺速/....
或者參閱先前的文章討論，
以上內容提供當作參考(我也不是科班出身的，僅是二年跑超過400片的經驗分享)
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1F：推 qiet: ...不懂phospho protein站的量會有什麼關係 04/28 19:57
2F：推 qiet: 何況跑WB根本不會知道phospho-protein的比例 04/28 20:02
3F：→ qiet: strip後和分開跑有差可能是沒有strip乾淨 04/28 20:03
4F：推 qiet: 你是不適把磷酸化蛋白壓出來訊號很強就當作量很多了 04/28 20:08
5F：→ aaaazzzz: 舉個極端的例子，如果跑完GAPDH再strip掉，再去壓同位置 04/28 20:28
6F：→ aaaazzzz: 的別的抗體，可能會看不到訊號或者訊號微弱 04/28 20:29
7F：→ aaaazzzz: 如果用strip沒乾淨似乎是個解釋，要證實的話是strip之後 04/28 20:31
8F：→ aaaazzzz: 淋上ECL去呈色(我是還沒這樣試過)看是否完全白片 04/28 20:32
9F：→ aaaazzzz: 之後再去上第二種抗體 04/28 20:34
10F：→ aaaazzzz: 還有我對phospho/total的比例感到好奇，很多paper不就是 04/28 20:36
11F：→ aaaazzzz: 跑western blotting定量，利用phospho/total的比例來算 04/28 20:37
12F：→ aaaazzzz: phospho protein的比例(雖然實務操作都知道這定量可能與 04/28 20:38
13F：→ aaaazzzz: 曝光時間長短選擇而有所差異) 04/28 20:38
14F：推 LIAR: 其實想知道strip有沒乾淨，光ECL不夠，還要補原本2抗，確定 04/30 00:09
15F：→ LIAR: 1抗有被洗掉，但就像你說的很囉唆，不同抗體的耐受性也不同 04/30 00:10
16F：→ LIAR: 如果抗體或strip buffer用很久，新一批來也會有差，麻煩啊 04/30 00:11
17F：推 icheee: 之前有機會用LICOR家的系統來試 stripping 的效率 真的不 04/30 07:00
18F：→ icheee: 是很好洗乾淨 04/30 07:01
19F：→ aaaazzzz: 原來還需要補原本2抗，謝謝L大(我用Bionovas這牌的 05/01 19:16
20F：→ aaaazzzz: stripping buffer,說明書還沒寫到這點) 05/01 19:16
21F：推 k60351p: 我是這篇的原原po~感謝你用心的回答了好多，我會再試試看 05/01 23:00
22F：→ k60351p: 條件的~感謝 05/01 23:00
23F：→ aaaazzzz: 祝實驗順利囉！ 05/02 19:05