作者aaaazzzz (找英文家教)
看板Biotech
标题Re: [求救] WB strip strip可信度
时间Fri Apr 28 17:29:48 2017
※ 引述《k60351p (misakilin)》之铭言：
: 想问一下版上的前辈们
: 我最近在跑WB
: 想看某个KINASE的磷酸化
: 依照别人的建议是先压PHOSPHO
: 再压TOTAL
: 但第一次结果出来磷酸化的确有改变趋势
: 但是TOTAL的部分也有改变的现象
: 不确定是否是strip所造成的误差还是什麽?
: （internal control没问题，抗体是abcam，commercial stripping buffer）
: 想问phospho跟total在同一个位子
: 用strip压是否有可信度的问题?
: （sample量有点多，如果都要跑二重覆会有加不完的班。。。）
phospho protein strip之後的membrane，是否会影响total的量，
要看是哪一种protein，
如果phospho比例占得很高，
strip之後确实会造成total量的改变，
但事实上没有人可以预知phospho占的比例有多高，
所以保险起见，我的作法是第一次的实验同时跑两片，
一片跑phospho-protein，第二片跑total protein，
隔天phospho-protein strip掉之後，
重新上一次total protein的抗体，
看看是否会跟单纯跑total protein的结果一致，
如果一致，之後第二、三...重复就直接把phospho strip掉，然後压total，
如果phospho影响到total的表现，那只好分两片跑，
以上是我的作法，缺点是非常耗时，
每次新条件的测试都得花上比别人多一倍的时间，
全实验室好像也只有我会这样做(好处当然是得到的实验结果比较容易再现)，
实际上因为这类的主题通常着重在phospho的改变，
如果希望得到total protein视觉上没有改变，
把曝光时间拉长，total protein看起来差异就不会太大，
所以一般助理与硕班学生普遍的做法就直接strip掉，
然後让total protein改变不要太大。
(除非phospho比例真的很大，磷酸化与一般抗体会竞争，
或者研究的主题是要看到protein在细胞空间的改变)
另外，分两片跑也有它的缺点，
因为使用了两片不同的internal control，
所以前提是Western blotting技术要熟练，定量要准确，跑起来的band都要很一致，
否则老师如果看到phospho或者total protein改变来自於internal control不同，
应该会很不开心，
(还有的缺点就是比较picky的reviewer可能要求在同一片，
不过我丢的杂志比较低分，是还没遇到要看原始data的reviewer)
对於刚做实验的硕班生，如果研究的phospho protein占很大的比例，
这的确是死穴(因跑同一片会影响，跑不同片每次internal control定量又不一致)
只能找有经验的学长姊帮忙，
最重要的是实验的结果大家都能够reproducible
: 另外想问，如果压出来的band偏淡，而且背景较深，是应该调二抗还是一抗的比例?还是应该调整blocking的方式
: （5%skim milk blocking ,santa cruz 的抗体（非磷酸化），一抗 1:500 二抗1:5000）
: 麻烦大家给我一点意见，谢谢
如果您的问题是针对刚刚phospho/total延伸，
我会提高一抗的比例，
如果单独压protein 一抗使用1:1000可得到好的视觉效果，
那strip之後的膜会把一抗抗体浓度提高到1:800以上，
二抗维持不变(二抗跟厂牌有关连性，某些厂牌浓度太高背景会变很脏)，
如果仅是针对一般的band没有表现，
一般会建议找个positive control，
(实际上要拿到会表现此protein的cell line也不容易)，
至於表现band微弱且背景深这原因就多罗，
band偏淡，解决方法包含提高protein的量/提高一抗/换别家抗体....
背景深，解决方法包含降低二抗/换别家抗体/增加wash时间或者摆速/....
或者参阅先前的文章讨论，
以上内容提供当作参考(我也不是科班出身的，仅是二年跑超过400片的经验分享)
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1F：推 qiet: ...不懂phospho protein站的量会有什麽关系 04/28 19:57
2F：推 qiet: 何况跑WB根本不会知道phospho-protein的比例 04/28 20:02
3F：→ qiet: strip後和分开跑有差可能是没有strip乾净 04/28 20:03
4F：推 qiet: 你是不适把磷酸化蛋白压出来讯号很强就当作量很多了 04/28 20:08
5F：→ aaaazzzz: 举个极端的例子，如果跑完GAPDH再strip掉，再去压同位置 04/28 20:28
6F：→ aaaazzzz: 的别的抗体，可能会看不到讯号或者讯号微弱 04/28 20:29
7F：→ aaaazzzz: 如果用strip没乾净似乎是个解释，要证实的话是strip之後 04/28 20:31
8F：→ aaaazzzz: 淋上ECL去呈色(我是还没这样试过)看是否完全白片 04/28 20:32
9F：→ aaaazzzz: 之後再去上第二种抗体 04/28 20:34
10F：→ aaaazzzz: 还有我对phospho/total的比例感到好奇，很多paper不就是 04/28 20:36
11F：→ aaaazzzz: 跑western blotting定量，利用phospho/total的比例来算 04/28 20:37
12F：→ aaaazzzz: phospho protein的比例(虽然实务操作都知道这定量可能与 04/28 20:38
13F：→ aaaazzzz: 曝光时间长短选择而有所差异) 04/28 20:38
14F：推 LIAR: 其实想知道strip有没乾净，光ECL不够，还要补原本2抗，确定 04/30 00:09
15F：→ LIAR: 1抗有被洗掉，但就像你说的很罗唆，不同抗体的耐受性也不同 04/30 00:10
16F：→ LIAR: 如果抗体或strip buffer用很久，新一批来也会有差，麻烦啊 04/30 00:11
17F：推 icheee: 之前有机会用LICOR家的系统来试 stripping 的效率 真的不 04/30 07:00
18F：→ icheee: 是很好洗乾净 04/30 07:01
19F：→ aaaazzzz: 原来还需要补原本2抗，谢谢L大(我用Bionovas这牌的 05/01 19:16
20F：→ aaaazzzz: stripping buffer,说明书还没写到这点) 05/01 19:16
21F：推 k60351p: 我是这篇的原原po~感谢你用心的回答了好多，我会再试试看 05/01 23:00
22F：→ k60351p: 条件的~感谢 05/01 23:00
23F：→ aaaazzzz: 祝实验顺利罗！ 05/02 19:05