作者palo1930 (隨欲而安)
看板Biotech
標題[求救] NRK52E West Blot actin飆高問題
時間Wed Apr 26 14:59:56 2017
各位版友大家好，目前正在做NRK52E這株細胞做westen，在壓actin確定定量時發現，隨
著細胞代數越高，做出來的ben也越來越高...製作westen前有用elisa定量，定量結果皆
在0.995以上，想問有做這株細胞或是在做細胞westen的版友有沒有發生類似的情況？
P.S實驗室4個人所製作的結果都一樣，actin皆是最大代數的sample ben標高。
P.SS把actin改成GAPDH結果也是一樣。
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1F：→ Ianthegood: western band 04/26 16:30
2F：→ Ianthegood: 定量結果怎麼會是0.995 那個應該是你的R square 04/26 16:31
3F：→ Ianthegood: cell lysate定量後跑膠染個coomassie或是銀染吧 如果 04/26 16:34
4F：→ Ianthegood: 有明顯的pattern不一樣那你這個line就不適合在沒有其 04/26 16:34
5F：→ Ianthegood: 他control的情況下做不同代數間的直接比較 04/26 16:34
6F：→ palo1930: 謝謝修改 情急之下自創不少單字.. 04/26 16:54
7F：→ palo1930: 目前被要求要找出飆高的原因，究竟是在最後收細胞時發 04/26 16:58
8F：→ palo1930: 生問題才造成飆高還是其他原因（比如手殘、定量不準） 04/26 16:58
9F：→ e104582001: 先染coomassie or ponceau S 確定總蛋白一樣多 04/26 17:22
10F：→ palo1930: 剛剛得知新消息...當初在收細胞時各line的濃度本來就不 04/28 11:08
11F：→ palo1930: 依，想請問這樣也會影響WB的band? 04/28 11:08
12F：→ Ianthegood: 細胞濃度不一樣？啊你定量是在做功德的喔 04/28 16:00
13F：→ Ianthegood: 幾頁前有一群文章wb control 定量 先去看完 04/28 16:02
14F：推 tynse71864: 細胞濃度是指 數量還是蛋白量呢？ 04/28 23:07
15F：→ palo1930: 數量.. 04/29 08:40
16F：→ Ianthegood: 我幫你整理一下厚，你說你收了不同代數的不同數量的 04/29 20:42
17F：→ Ianthegood: 細胞，用elisa定量後(用elisa定我也是很好奇，也沒講 04/29 20:42
18F：→ Ianthegood: 用哪隻抗體做elisa)，得到Rsquare，沒講有沒有做任何 04/29 20:42
19F：→ Ianthegood: 樣的normalisation，跑膠壓western，得到的actin不一 04/29 20:42
20F：→ Ianthegood: 樣粗。是這樣嗎？ 04/29 20:42
21F：→ blence: 他說的0.995應該是standard R^2,不是定量的OD,Elisa定量應 04/29 21:27
22F：→ blence: 該是指用multiplate reader測bradford或BCA的結果 04/29 21:30
23F：→ Ianthegood: 我也覺得是r^2啊 但是他也沒放任何的quantitation 04/30 03:35
24F：→ palo1930: 0.995是用標準蛋白加入96 wall後使用Elisa, OD 590下去 05/01 11:05
25F：→ palo1930: 跑，得出的數值計算R^2，在加入標準蛋白也會加入欲側sam 05/01 11:05
26F：→ palo1930: ple。（第一次發問交代的不清楚不好意思） 05/01 11:05
27F：→ palo1930: "再"加入,欲"測" 05/01 11:06
28F：→ palo1930: I大說的是！是收了不同代數、不同數量的細胞，經過elisa 05/01 11:10
29F：→ palo1930: 標準蛋白定量後組成跑WB的sample，但是得出來的actin及G 05/01 11:10
30F：→ palo1930: APDH 粗細卻不一樣。 05/01 11:10
31F：→ Ianthegood: 這個blence兄要不要處理一下 05/01 15:49
32F：→ blence: 我的想法就那些,你都說完了阿 05/02 06:25
33F：→ blence: 從原po描述用詞,有像教的學長姊只講操作流程沒教方法原理 05/02 06:46
34F：→ blence: 如果是這樣,老師應該要來解決,而不是埋頭苦做 05/02 06:50
35F：→ palo1930: 謝謝B大，也講到一個重點...只有教流程沒有教原理，這 05/02 16:35
36F：→ palo1930: 部分會自己再和老師討論和進修！撇除流程滿多東西都是 05/02 16:35
37F：→ palo1930: 自己摸索所以一知半解，謝謝 05/02 16:35