大家好，又是我，但這次有新的問題，所以借用實驗設計時參考的文章 這次是做single site 的 site-directed mutagenesis 我有個Toxic insert一直很難clone，好不容易篩到colony卻有frameshift mutation 所以我參考這篇文章跟內容提到的paper做了SDA想把Sequence 矯正回來 我用的competent cells是clontech的stellar competent cells transformation後用30度C recover然後室溫養兩天 挑了三個colony送定序其中兩個有把我要的序列改回來 但都出現了新的Deletion或insertion 下面是其中一個plasmid的結果 序列從 TCACTTTTGATGTTCACACG-GAG 變成 TCACTTT-GATGTTCACACTCAAG ↑不要 ***要 出現新的mutation的位置都在primer上，F跟R都有 我想請問 1. 這跟primer有關嗎？ 2. 這在Site-directed mutagenesis常見嗎，因為我是第一次試實在沒甚麼經驗 3. 還是純粹就是我的insert不穩定，competent cell喜歡自己亂改序列orz 4. 可否提供我任何建議或可以嘗試的方向 指導老師說再不行就insert砍半或直接用合成的 謝謝！！ ※ 引述《tutj (人生若只初相見)》之銘言： : ※ 引述《nhxcyge (人生就像個不可逆反應)》之銘言： : : 我現在是做A基因的點突變， : : 用的方法是利用complement primer 25bp，而突變設計在中間 : complement primer應該是stratagene QuikChange的方法吧？ : : 利用這組primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小約6.7kb : : 目前卡在PCR出來的產物很少很少，以致於做transform後都沒有colony長出來… : : 曾想過把多管PCR產物跑膠(先以DpnI digest)後，把少量的產物集中一起elution : : 但濃度還是很低(1.1 ng/ul)。 : : 另外因此突變點位在基因末端(離stop codon約30bp,全長約1.4kb)，所以用下述方法 : : 心想應該行不通 : : F1----------> F2---------> : : ------------------------------------------------------ : : |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| : : ------------------------------------------------------ : : R1<--------- : : R2<---------- : : 二段PCR產物overlap處為mutation site，不過會變成F1、R1夾出來1300多bp而F2、R2 : : 夾出來可能100bp不到的產物，再將二個大小差距那麼大的產物加在一起覺得不太可行。 : : 所以想請問版上有人遇過這種狀況嗎？ : : Primer重新order過了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。 : 你的Tm值是照說明書的公式算的嗎？ : 我有找到一個網站可以幫忙算 : http://depts.washington.edu/bakerpg/primertemp/primertemp.html : 如果你是照公式算, 說明書要求至少要78℃以上; 如果不是, 那Tm值一定太低 : 這方法Tm值一定要夠高。因為primer完全complement, 還有突變的base : 所以primer間的Tm值會比primer對DNA template的Tm值高 : 如果一開始設計的Tm不夠高 : PCR時primer會傾向形成primer dimer而不是黏上DNA template : 至於你說的PCR產量低, 我之前有找到一篇paper : 裡面說QuikChange有幾個缺點。 一是上面提的易形成primer dimer : 二是不能同時多點突變; 三就是PCR產量低。 : 因為PCR從primer順著plasmid跑完一圈後頭尾接不起來形成nick : 一對primer又是完全complement : 整個PCR program只有parental plasmid可以做為DNA template : 那篇paper發明了一種新方法 : F1 ---------m-----------> : ------------------*----------------------------------- *: nick : |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| m: mutation : -----------------------------------*------------------ : R1<-----------------m------ : 如圖, primer間只有部份overlap, mutation site在overlap region中間 : 3'延伸出去的部份蓋過PCR產物的nick : 所以新生成帶有mutation的DNA可以當成template進刪PCR reaction : 故一開始需要加入的DNA template可以降低, 提高之後挑mutant colony的機率 : paper現在不在手邊, 如果你有興趣等星期一去實驗室我可以提供 : 根據我整理的protocol : 這邊primer跟template之間的Tm值稱為Tm no, primer-primer間的Tm稱為Tm pp : 設計primer時Tm no要比Tm pp高5~10℃ : PCR reaction的配方: 1x PCR reaction buffer, 1 uM primer pair, : 2~10 ng DNA template (我用5 ng), 0.2 mM each dNTP (我怕不夠加到0.4 mM) : 3u Pfu polymerase (其他DNA polymerase應該也可以), 補水到50 ul : PCR program: : 1. 95℃ 5 min x1 cycle : 2. 95℃ 1 min (cycle數我照QuikChange的建議, 換掉a.a.跑16 cycles) : Tm no-5℃ 1 min : 72℃ 1 kp/2 min : 3. 95℃ 1 min x1 cycle : Tm pp-5℃ 1 min : 72℃ 30min (據說此cycle能增加完整plasmid的生成率) : elongation因為我用PfuUlatr II, 所以減到1 kb/min, 跑68℃ : 然後primer因為高GC% Tm值超高,減五度也超過65℃ : 所以annealing照QuikChange跑55℃ 最後一個cycle省略成只跑72℃ 30min : 取10 ul PCR product跑膠有超亮的single band : 提供給你參考~ --

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