大家好，又是我，但这次有新的问题，所以借用实验设计时参考的文章 这次是做single site 的 site-directed mutagenesis 我有个Toxic insert一直很难clone，好不容易筛到colony却有frameshift mutation 所以我参考这篇文章跟内容提到的paper做了SDA想把Sequence 矫正回来 我用的competent cells是clontech的stellar competent cells transformation後用30度C recover然後室温养两天 挑了三个colony送定序其中两个有把我要的序列改回来 但都出现了新的Deletion或insertion 下面是其中一个plasmid的结果 序列从 TCACTTTTGATGTTCACACG-GAG 变成 TCACTTT-GATGTTCACACTCAAG ↑不要 ***要 出现新的mutation的位置都在primer上，F跟R都有 我想请问 1. 这跟primer有关吗？ 2. 这在Site-directed mutagenesis常见吗，因为我是第一次试实在没甚麽经验 3. 还是纯粹就是我的insert不稳定，competent cell喜欢自己乱改序列orz 4. 可否提供我任何建议或可以尝试的方向 指导老师说再不行就insert砍半或直接用合成的 谢谢！！ ※ 引述《tutj (人生若只初相见)》之铭言： : ※ 引述《nhxcyge (人生就像个不可逆反应)》之铭言： : : 我现在是做A基因的点突变， : : 用的方法是利用complement primer 25bp，而突变设计在中间 : complement primer应该是stratagene QuikChange的方法吧？ : : 利用这组primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小约6.7kb : : 目前卡在PCR出来的产物很少很少，以致於做transform後都没有colony长出来… : : 曾想过把多管PCR产物跑胶(先以DpnI digest)後，把少量的产物集中一起elution : : 但浓度还是很低(1.1 ng/ul)。 : : 另外因此突变点位在基因末端(离stop codon约30bp,全长约1.4kb)，所以用下述方法 : : 心想应该行不通 : : F1----------> F2---------> : : ------------------------------------------------------ : : |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| : : ------------------------------------------------------ : : R1<--------- : : R2<---------- : : 二段PCR产物overlap处为mutation site，不过会变成F1、R1夹出来1300多bp而F2、R2 : : 夹出来可能100bp不到的产物，再将二个大小差距那麽大的产物加在一起觉得不太可行。 : : 所以想请问版上有人遇过这种状况吗？ : : Primer重新order过了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。 : 你的Tm值是照说明书的公式算的吗？ : 我有找到一个网站可以帮忙算 : http://depts.washington.edu/bakerpg/primertemp/primertemp.html : 如果你是照公式算, 说明书要求至少要78℃以上; 如果不是, 那Tm值一定太低 : 这方法Tm值一定要够高。因为primer完全complement, 还有突变的base : 所以primer间的Tm值会比primer对DNA template的Tm值高 : 如果一开始设计的Tm不够高 : PCR时primer会倾向形成primer dimer而不是黏上DNA template : 至於你说的PCR产量低, 我之前有找到一篇paper : 里面说QuikChange有几个缺点。 一是上面提的易形成primer dimer : 二是不能同时多点突变; 三就是PCR产量低。 : 因为PCR从primer顺着plasmid跑完一圈後头尾接不起来形成nick : 一对primer又是完全complement : 整个PCR program只有parental plasmid可以做为DNA template : 那篇paper发明了一种新方法 : F1 ---------m-----------> : ------------------*----------------------------------- *: nick : |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| m: mutation : -----------------------------------*------------------ : R1<-----------------m------ : 如图, primer间只有部份overlap, mutation site在overlap region中间 : 3'延伸出去的部份盖过PCR产物的nick : 所以新生成带有mutation的DNA可以当成template进删PCR reaction : 故一开始需要加入的DNA template可以降低, 提高之後挑mutant colony的机率 : paper现在不在手边, 如果你有兴趣等星期一去实验室我可以提供 : 根据我整理的protocol : 这边primer跟template之间的Tm值称为Tm no, primer-primer间的Tm称为Tm pp : 设计primer时Tm no要比Tm pp高5~10℃ : PCR reaction的配方: 1x PCR reaction buffer, 1 uM primer pair, : 2~10 ng DNA template (我用5 ng), 0.2 mM each dNTP (我怕不够加到0.4 mM) : 3u Pfu polymerase (其他DNA polymerase应该也可以), 补水到50 ul : PCR program: : 1. 95℃ 5 min x1 cycle : 2. 95℃ 1 min (cycle数我照QuikChange的建议, 换掉a.a.跑16 cycles) : Tm no-5℃ 1 min : 72℃ 1 kp/2 min : 3. 95℃ 1 min x1 cycle : Tm pp-5℃ 1 min : 72℃ 30min (据说此cycle能增加完整plasmid的生成率) : elongation因为我用PfuUlatr II, 所以减到1 kb/min, 跑68℃ : 然後primer因为高GC% Tm值超高,减五度也超过65℃ : 所以annealing照QuikChange跑55℃ 最後一个cycle省略成只跑72℃ 30min : 取10 ul PCR product跑胶有超亮的single band : 提供给你参考~ --

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