作者knowledge265 (lonelyvenice)
看板Biotech
標題[求救]Bradford定量法求助
時間Tue Mar 28 00:53:51 2017
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題
若是求救事項涉及實驗室智慧財產(例如細胞細菌植株、質體載體等）之分讓，
請務必註明貴實驗室願意設立 正式合作或 簽署材料分讓協議(MTA)，否則版工將逕行刪除
----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章----
因為實驗室以往做western blot都是用2X denature sample buffer(不定量)直接去溶蛋
白,沸水煮5-10分鐘,離心就直接開始跑
最近開始想用lysis buffer以bradford配上BSA定量方式去做比較準確,而我實驗室上面沒
人能教我只能自己摸索,請各位指教一下
BSA先稀釋成0.5mg/ml 再開始拉標準曲線
BSA(0.5mg/ml) 1 X Bradford 最終濃度(ug/ml)
500ul 0 0
495ul 5ul 5
490ul 10ul 10
480ul 20ul 20
450ul 50ul 50
475ul 75ul 75
400ul 100ul 100
然後以595nm測吸光值 拉標準曲線 得y=0.012x+0.458
再來測我的樣品蛋白是以
1 x Bradford 499 ul 配上 樣品蛋白 1 ul 再測吸光值後帶入標準曲線
舉例我其中一個樣品測得為24.08請問單位是ug/ml還是mg/ml?
而我要不要把499ul 的bradford看做稀釋再把倍率乘回去呢?
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1F：推 ad1980: 跟你用來測吸光值的 BSA 同樣的單位 03/28 04:12
2F：→ ad1980: 你畫 standard curve 時 BSA 那個軸是用什麼單位，你的 sa 03/28 04:15
3F：→ ad1980: mple 算出來就是那個單位。 03/28 04:15
4F：推 icheee: 看了一下覺得跟我看過/做過的方式不同... 一般不是都把 03/28 08:26
5F：→ icheee: BSA 標準品作為限量試劑, 然後用相同量 (過量) 的 Bradf- 03/28 08:27
6F：→ icheee: ord reagent 去反應嗎? 03/28 08:27
7F：推 qiet: 你這樣不是每一管的Bradford reagent量都不同嗎 03/28 09:17
8F：→ qiet: 產品protcol先看看吧 03/28 09:19
9F：推 icheee: 這條檢量線看起來比較像在做 Bradford reagent conc. 的檢 03/28 10:18
10F：→ icheee: 量線... 03/28 10:18
11F：→ knowledge265: 抱歉我上面標準曲線打反了 03/28 11:14
12F：→ knowledge265: Bradford是500 495 490那排 03/28 11:14
13F：推 icheee: 如 q 大所說, 一般作法是固定 reagent 的量 + 固定 sample 03/28 11:31
14F：→ icheee: 的量 (指體積). 所以假設 Bradford sol'n 都用 500 uL, 樣 03/28 11:31
15F：→ icheee: 品/標準品都用 20 uL (體積不足用水或溶解/稀釋 BSA 的溶 03/28 11:33
16F：→ icheee: 劑補). 這樣再回來看, 應該你的問題就可以解決了. 03/28 11:34
17F：→ icheee: 至於如果硬要用你現在的步驟來看, 你測得的 24.08 是 ug/ 03/28 11:35
18F：→ icheee: mL. 按你的目的是該把稀釋倍率考慮進去 (*500), 推回原本 03/28 11:36
19F：→ icheee: 的濃度. (要用 ug/mL 或 mg/mL 表示就看你認為怎樣恰當) 03/28 11:37
20F：→ knowledge265: 所以次哦這樣定的方式也是可以的囉？ 03/28 17:23
21F：推 rusly: 你有實驗的protocol嗎，為啥跟大家學的好像不一樣？ 03/31 20:44
22F：推 icheee: 不行吧 我只是直接回答你問題 04/01 05:44
23F：推 formoxa: 為什麼不跟著產品說明書做一次。 04/07 18:18