作者knowledge265 (lonelyvenice)
看板Biotech
标题[求救]Bradford定量法求助
时间Tue Mar 28 00:53:51 2017
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
若是求救事项涉及实验室智慧财产(例如细胞细菌植株、质体载体等）之分让，
请务必注明贵实验室愿意设立 正式合作或 签署材料分让协议(MTA)，否则版工将迳行删除
----请将上列注意事项以 ctrl + k 删除後开始编辑文章----
因为实验室以往做western blot都是用2X denature sample buffer(不定量)直接去溶蛋
白,沸水煮5-10分钟,离心就直接开始跑
最近开始想用lysis buffer以bradford配上BSA定量方式去做比较准确,而我实验室上面没
人能教我只能自己摸索,请各位指教一下
BSA先稀释成0.5mg/ml 再开始拉标准曲线
BSA(0.5mg/ml) 1 X Bradford 最终浓度(ug/ml)
500ul 0 0
495ul 5ul 5
490ul 10ul 10
480ul 20ul 20
450ul 50ul 50
475ul 75ul 75
400ul 100ul 100
然後以595nm测吸光值 拉标准曲线 得y=0.012x+0.458
再来测我的样品蛋白是以
1 x Bradford 499 ul 配上 样品蛋白 1 ul 再测吸光值後带入标准曲线
举例我其中一个样品测得为24.08请问单位是ug/ml还是mg/ml?
而我要不要把499ul 的bradford看做稀释再把倍率乘回去呢?
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1F：推 ad1980: 跟你用来测吸光值的 BSA 同样的单位 03/28 04:12
2F：→ ad1980: 你画 standard curve 时 BSA 那个轴是用什麽单位，你的 sa 03/28 04:15
3F：→ ad1980: mple 算出来就是那个单位。 03/28 04:15
4F：推 icheee: 看了一下觉得跟我看过/做过的方式不同... 一般不是都把 03/28 08:26
5F：→ icheee: BSA 标准品作为限量试剂, 然後用相同量 (过量) 的 Bradf- 03/28 08:27
6F：→ icheee: ord reagent 去反应吗? 03/28 08:27
7F：推 qiet: 你这样不是每一管的Bradford reagent量都不同吗 03/28 09:17
8F：→ qiet: 产品protcol先看看吧 03/28 09:19
9F：推 icheee: 这条检量线看起来比较像在做 Bradford reagent conc. 的检 03/28 10:18
10F：→ icheee: 量线... 03/28 10:18
11F：→ knowledge265: 抱歉我上面标准曲线打反了 03/28 11:14
12F：→ knowledge265: Bradford是500 495 490那排 03/28 11:14
13F：推 icheee: 如 q 大所说, 一般作法是固定 reagent 的量 + 固定 sample 03/28 11:31
14F：→ icheee: 的量 (指体积). 所以假设 Bradford sol'n 都用 500 uL, 样 03/28 11:31
15F：→ icheee: 品/标准品都用 20 uL (体积不足用水或溶解/稀释 BSA 的溶 03/28 11:33
16F：→ icheee: 剂补). 这样再回来看, 应该你的问题就可以解决了. 03/28 11:34
17F：→ icheee: 至於如果硬要用你现在的步骤来看, 你测得的 24.08 是 ug/ 03/28 11:35
18F：→ icheee: mL. 按你的目的是该把稀释倍率考虑进去 (*500), 推回原本 03/28 11:36
19F：→ icheee: 的浓度. (要用 ug/mL 或 mg/mL 表示就看你认为怎样恰当) 03/28 11:37
20F：→ knowledge265: 所以次哦这样定的方式也是可以的罗？ 03/28 17:23
21F：推 rusly: 你有实验的protocol吗，为啥跟大家学的好像不一样？ 03/31 20:44
22F：推 icheee: 不行吧 我只是直接回答你问题 04/01 05:44
23F：推 formoxa: 为什麽不跟着产品说明书做一次。 04/07 18:18