作者windyflyer (重新尋找)
看板Biotech
標題[求救] 螢光蛋白fusion protein 表現
時間Thu Mar 23 14:35:21 2017
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題
若是求救事項涉及實驗室智慧財產(例如細胞細菌植株、質體載體等）之分讓，
請務必註明貴實驗室願意設立 正式合作或 簽署材料分讓協議(MTA)，否則版工將逕行刪除
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各位大大好
我最近在試圖接一段fusion protein，預計將mCherry接在我要表現的A protein的N端
一開始之所以會決定接在N端是因為有PAPER將RFP接在A protein的N端，所以才打算
照做。我的mCherry與A protein中間有間隔約10個胺基酸。有確定in-frame。
但接完之後送細胞→收cell lysate並以mCherry抗體卻沒有東西T_T倒是單純mCherry
表現載體則是有band的。收protein之前看螢光，fusion protein也是沒有亮，而單純
表現mCherry則有發光。
當初接好後因為A protein大小過大(3399bp)所以沒定序就直接送細胞測試了。
想請問大家的意見@@"因為我不確定這樣的fusion protein是不是太大了才導致整個蛋
白表現瓦解?
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1F：→ Ianthegood: rfp跟mcherry同源嗎? 我自己沒做不過我們lab的mcherry 03/23 16:10
2F：→ Ianthegood: 都放在C-ter 03/23 16:10
3F：→ Ianthegood: 要定序啦 另外可以做RT看mrna有沒表現 03/23 16:12
4F：推 tynse71864: 有用A Ab去認過fusion protein嗎 03/23 16:58
5F：推 Bows: mCherry 的 stop codon? 03/23 17:32
6F：推 Bows: 沒事，應該不會是這個ㄩㄢㄧ 03/23 17:34
7F：→ windyflyer: 有 但沒看到任何shift@@" 03/23 18:56
8F：→ windyflyer: 已經貼細胞下去要收RNA了 不過對於沒螢光/沒protein 03/23 18:56
9F：→ windyflyer: 這件事感到疑惑QAQ 03/23 18:57
10F：→ Ianthegood: 中間linker的sequence? 03/23 19:09
11F：→ blence: 都沒定序如何知道是A,是A從別的plasmid切來的? 該plasmid 03/23 20:34
12F：→ blence: 應該也沒定序,這樣如何知道是in-frame呢？ 03/23 20:35
13F：→ blence: 猜測源頭有問題,因為若A在其他plasmid表現過,文中應該會提 03/23 20:41
14F：→ a90648: 我蠻好奇因為3399bp而沒定序的原因是? 03/24 01:08
15F：→ a90648: transient transfection做Q，DNaseI要處理好喔 03/24 01:10
16F：→ a90648: 免得P到的都是丟進去的那堆plasmid 03/24 01:11
17F：→ a90648: 染mCherry時是整片染還是裁預計大小上下一點的部分看而已? 03/24 01:15
18F：→ windyflyer: 我重新clone一次之後有壓出來了~位置都對T_T 06/22 21:44