作者windyflyer (重新寻找)
看板Biotech
标题[求救] 萤光蛋白fusion protein 表现
时间Thu Mar 23 14:35:21 2017
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
若是求救事项涉及实验室智慧财产(例如细胞细菌植株、质体载体等）之分让，
请务必注明贵实验室愿意设立 正式合作或 签署材料分让协议(MTA)，否则版工将迳行删除
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各位大大好
我最近在试图接一段fusion protein，预计将mCherry接在我要表现的A protein的N端
一开始之所以会决定接在N端是因为有PAPER将RFP接在A protein的N端，所以才打算
照做。我的mCherry与A protein中间有间隔约10个胺基酸。有确定in-frame。
但接完之後送细胞→收cell lysate并以mCherry抗体却没有东西T_T倒是单纯mCherry
表现载体则是有band的。收protein之前看萤光，fusion protein也是没有亮，而单纯
表现mCherry则有发光。
当初接好後因为A protein大小过大(3399bp)所以没定序就直接送细胞测试了。
想请问大家的意见@@"因为我不确定这样的fusion protein是不是太大了才导致整个蛋
白表现瓦解?
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1F：→ Ianthegood: rfp跟mcherry同源吗? 我自己没做不过我们lab的mcherry 03/23 16:10
2F：→ Ianthegood: 都放在C-ter 03/23 16:10
3F：→ Ianthegood: 要定序啦 另外可以做RT看mrna有没表现 03/23 16:12
4F：推 tynse71864: 有用A Ab去认过fusion protein吗 03/23 16:58
5F：推 Bows: mCherry 的 stop codon? 03/23 17:32
6F：推 Bows: 没事，应该不会是这个ㄩㄢㄧ 03/23 17:34
7F：→ windyflyer: 有 但没看到任何shift@@" 03/23 18:56
8F：→ windyflyer: 已经贴细胞下去要收RNA了 不过对於没萤光/没protein 03/23 18:56
9F：→ windyflyer: 这件事感到疑惑QAQ 03/23 18:57
10F：→ Ianthegood: 中间linker的sequence? 03/23 19:09
11F：→ blence: 都没定序如何知道是A,是A从别的plasmid切来的? 该plasmid 03/23 20:34
12F：→ blence: 应该也没定序,这样如何知道是in-frame呢？ 03/23 20:35
13F：→ blence: 猜测源头有问题,因为若A在其他plasmid表现过,文中应该会提 03/23 20:41
14F：→ a90648: 我蛮好奇因为3399bp而没定序的原因是? 03/24 01:08
15F：→ a90648: transient transfection做Q，DNaseI要处理好喔 03/24 01:10
16F：→ a90648: 免得P到的都是丢进去的那堆plasmid 03/24 01:11
17F：→ a90648: 染mCherry时是整片染还是裁预计大小上下一点的部分看而已? 03/24 01:15
18F：→ windyflyer: 我重新clone一次之後有压出来了~位置都对T_T 06/22 21:44