作者boblu (六百)
看板Biotech
標題Re: [求救] PCR 結果一直不理想或沒東西
時間Fri Feb 17 02:15:45 2017
你如果只是要鑑別你的 transgenic mice 身上帶的 transgene 是 A or B
好像不需要 PCR 全長吧？
不是說中間有 400 bp 差異比較大？
那就針對這個區域設計 A specific 跟 B specific 的 primers 啊
每一隻老鼠的 genomic DNA 拿來跑針對 A 以及針對 B 的兩個 PCR
看哪個有跑出來就知道誰是誰
目標 400bp 容易 PCR 而且這樣連 sequencing 都免了
甚至 你可以利用 A 與 B 在那 400 bp 以外的區域高度相似的特性
把 primer 設計成 AB-F(universal), A-R, B-R 三個
並設計成 AB-F + A-R 以及 AB-F + B-R 的產物 size 不同
三個 primer 放一個 PCR 反應跑 看產物大小就完成 genotyping 的目的惹
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1F：→ Ianthegood: 哎呦對嘛 這才叫proper typing 02/17 06:18
2F：推 taya1991: (做筆記中) 先謝謝六百！！ 02/17 08:14
3F：推 taya1991: 結果兩個gene實在太相似，這方法行不通，還是感謝！ 02/17 12:51
4F：→ boblu: 一條 primer 3' 最後那一個 base mismatch 就 PCR 不出了 02/17 13:04
5F：→ boblu: 利用這個特性點突變都可以 PCR genotyping 02/17 13:04
6F：→ boblu: 雖然實務上這種技巧有時有效有時沒效 case by case 02/17 13:06
7F：→ boblu: 另外真的覺得定序才安心的話 02/17 13:07
8F：→ boblu: 我還是建議不需要定全長 你挑一段 300bp 上下的去 PCR 就好 02/17 13:08
9F：推 jabari: 那不如改成用qPCR跑HRM看melting差異.... 咦? 02/17 13:58
10F：→ boblu: HRM好方法啊 只是原po不一定有設備 02/17 22:49