作者xenograft (努力嘗試學以致用中)
看板Biotech
標題[求救] his protein western blotting 相關問題
時間Thu Nov 10 16:31:33 2016
想請問表現His tag的膜蛋白是否需要純化才能以western blotting的方式偵測到?
我們的實驗在膜蛋白上接有His tag，將其transfect into 293T cell，收細胞以RIPA ly
sis cell，而後lysate直接跑PAGE，再進行western blotting
此外細胞同時還有抽DNA確認transfection成功，抽RNA確認該蛋白mRNA有表現，同時也有
染FA確認該蛋白表現(anti-His)，以上三個實驗結果都確認該蛋白的確有表現
然而我們執行western blotting的結果卻是什麼都無法得到，二抗很明顯都認到背景，在
預期的位置完全沒有東西...
由染色結果來看，此蛋白表現強度還可以不過transfection效率不好，大概僅有5%，因此
想請問是因為transfection效率低導致無法染到，還是His tag蛋白本身就需要先純化才
能進行western blotting?
在此先謝謝各位了
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1F：推 darrenyo: 有positive嗎？沒有his tag的western有做出來嗎 11/10 17:15
2F：→ xenograft: 沒有his tag的western做的出來 11/10 18:04
3F：推 lail: 理論上不用 11/10 19:12
4F：→ lail: 另外293T應該轉染率很高，你可能要想辦法提高轉染率 11/10 19:13
5F：推 lycantrope: transfection效率太低 target protein太少 11/10 23:14
6F：→ enjorus: 293T只有5%，這個很怪。然後另個可以調整的是Western 11/11 19:57
7F：→ enjorus: 部份，有沒有可能蛋白質都沒下來卡在well之類的。 11/11 19:58
8F：→ enjorus: 因為我不知道你的膜蛋白分子量多大 11/11 19:59
9F：推 DKKing: 有positive control嗎？抗體之前有成功過的data嗎？如果沒 11/12 12:16
10F：→ DKKing: 有，可能是抗體出問題吧！ 11/12 12:16
11F：推 GG810424: 直接認His tag 後面的蛋白 11/16 12:32
12F：→ GG810424: His tag antibody 在抗體市場目前很少有好的抗體 11/16 12:33
13F：→ GG810424: 我有用過不錯的his antibody ，要的話可以借你試試，不 11/16 12:34
14F：→ GG810424: 過我在中研院 11/16 12:34
15F：推 GG810424: His purification 可以用Qiagen 的Ni-NTA agarose beads 11/16 12:36
16F：→ xenograft: 謝謝大家，後來找到問題了，的確是抗體結合力不好，一 11/23 00:41
17F：→ xenograft: 抗改成放4度overnight就成功了 11/23 00:41