作者xenograft (努力尝试学以致用中)
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标题[求救] his protein western blotting 相关问题
时间Thu Nov 10 16:31:33 2016
想请问表现His tag的膜蛋白是否需要纯化才能以western blotting的方式侦测到?
我们的实验在膜蛋白上接有His tag，将其transfect into 293T cell，收细胞以RIPA ly
sis cell，而後lysate直接跑PAGE，再进行western blotting
此外细胞同时还有抽DNA确认transfection成功，抽RNA确认该蛋白mRNA有表现，同时也有
染FA确认该蛋白表现(anti-His)，以上三个实验结果都确认该蛋白的确有表现
然而我们执行western blotting的结果却是什麽都无法得到，二抗很明显都认到背景，在
预期的位置完全没有东西...
由染色结果来看，此蛋白表现强度还可以不过transfection效率不好，大概仅有5%，因此
想请问是因为transfection效率低导致无法染到，还是His tag蛋白本身就需要先纯化才
能进行western blotting?
在此先谢谢各位了
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1F：推 darrenyo: 有positive吗？没有his tag的western有做出来吗 11/10 17:15
2F：→ xenograft: 没有his tag的western做的出来 11/10 18:04
3F：推 lail: 理论上不用 11/10 19:12
4F：→ lail: 另外293T应该转染率很高，你可能要想办法提高转染率 11/10 19:13
5F：推 lycantrope: transfection效率太低 target protein太少 11/10 23:14
6F：→ enjorus: 293T只有5%，这个很怪。然後另个可以调整的是Western 11/11 19:57
7F：→ enjorus: 部份，有没有可能蛋白质都没下来卡在well之类的。 11/11 19:58
8F：→ enjorus: 因为我不知道你的膜蛋白分子量多大 11/11 19:59
9F：推 DKKing: 有positive control吗？抗体之前有成功过的data吗？如果没 11/12 12:16
10F：→ DKKing: 有，可能是抗体出问题吧！ 11/12 12:16
11F：推 GG810424: 直接认His tag 後面的蛋白 11/16 12:32
12F：→ GG810424: His tag antibody 在抗体市场目前很少有好的抗体 11/16 12:33
13F：→ GG810424: 我有用过不错的his antibody ，要的话可以借你试试，不 11/16 12:34
14F：→ GG810424: 过我在中研院 11/16 12:34
15F：推 GG810424: His purification 可以用Qiagen 的Ni-NTA agarose beads 11/16 12:36
16F：→ xenograft: 谢谢大家，後来找到问题了，的确是抗体结合力不好，一 11/23 00:41
17F：→ xenograft: 抗改成放4度overnight就成功了 11/23 00:41