作者Bows (包斯 一兵 >>)
看板Biotech
標題[求救] Aβ peptide western blot
時間Tue Nov 1 21:50:36 2016
在下最近在做有關阿茲海默症的研究
需要以 Western blot 去看Aβ(β-amyloid, 4.5kDa) 及其聚合物在 model 中的表現量
此 model 經 ELISA 以及 IHC 偵測後確認有 Aβ 的表現
但以 western blot 去壓，則是完全無法看到 band
以下是 protocol
Gel: 15% tris-tricine gel
Runnung buffer:
Cathode (1L):Tris-base 12.1g
Tricine 17.9g
SDS 1g
pH 8.8
Anode (1L): 0.2M Tris-base pH 8.8
跑完膠後以160mA/1hr (以調整過時間，再減少會轉不上membrane)
以全濕式轉漬 transfer 至 0.22μm PVDF
Transfer buffer (1L):
Tris-base 3g
Glycine 14.4g
MeOH 200 ml
Transfer 後以5%脫脂奶粉 blocking
後以 6E10 antibody 1:1000 hybrid overnight
以TBST wash 20 min/3 times
再以2抗 1:5000 hybrid 1hr
後 TBST wash 20 min/3 times
接著ECL顯影，結果均看不到12kDa以下的band 如圖
http://imgur.com/tc89Lpj
也有切開hybrid過亦看不到訊號，目前推測是在樣品前處理 (RIPA buffer)中未加PMSF
請問這過程有什麼需要注意的問題嗎?
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1F：推 tynse71864: 可能就是 lysis時 degrade光了吧 另外 transfer buf 11/02 22:13
2F：→ tynse71864: fer建議不要 reuse(在這個實驗裡) 11/02 22:13
3F：→ tynse71864: MeOH比例下降會讓小分子較易飄走 11/02 22:15
4F：推 tynse71864: 還有你的 Mr只有10 確定4.5沒跳海嗎？ (雖然我覺得15 11/02 22:20
5F：→ tynse71864: %tricine gel應該是沒問題 11/02 22:20
6F：→ Bows: 我們的transfer buffer都沒有在 reuse 的，會覺得是degree 11/03 00:51
7F：→ Bows: 的原因其實是有在跑 abeta peptide 在右邊下面有很淡的band 11/03 00:51
8F：→ Bows: *degrade 11/03 00:51
9F：推 elelith: 如果要重跑 建議用有2KD的MK monomer dimer 都小於10 11/03 14:53
10F：→ elelith: 就算elisa和IHC有 WB也有可能訊號不夠強壓不出來 11/03 14:56
11F：→ Bows: 我其實有用 2kDa 的marker 去跑，只是手邊圖看不清楚，很容 11/03 23:24
12F：→ Bows: 易飄掉 11/03 23:24