作者Bows (包斯 一兵 >>)
看板Biotech
标题[求救] Aβ peptide western blot
时间Tue Nov 1 21:50:36 2016
在下最近在做有关阿兹海默症的研究
需要以 Western blot 去看Aβ(β-amyloid, 4.5kDa) 及其聚合物在 model 中的表现量
此 model 经 ELISA 以及 IHC 侦测後确认有 Aβ 的表现
但以 western blot 去压，则是完全无法看到 band
以下是 protocol
Gel: 15% tris-tricine gel
Runnung buffer:
Cathode (1L):Tris-base 12.1g
Tricine 17.9g
SDS 1g
pH 8.8
Anode (1L): 0.2M Tris-base pH 8.8
跑完胶後以160mA/1hr (以调整过时间，再减少会转不上membrane)
以全湿式转渍 transfer 至 0.22μm PVDF
Transfer buffer (1L):
Tris-base 3g
Glycine 14.4g
MeOH 200 ml
Transfer 後以5%脱脂奶粉 blocking
後以 6E10 antibody 1:1000 hybrid overnight
以TBST wash 20 min/3 times
再以2抗 1:5000 hybrid 1hr
後 TBST wash 20 min/3 times
接着ECL显影，结果均看不到12kDa以下的band 如图
http://imgur.com/tc89Lpj
也有切开hybrid过亦看不到讯号，目前推测是在样品前处理 (RIPA buffer)中未加PMSF
请问这过程有什麽需要注意的问题吗?
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1F：推 tynse71864: 可能就是 lysis时 degrade光了吧 另外 transfer buf 11/02 22:13
2F：→ tynse71864: fer建议不要 reuse(在这个实验里) 11/02 22:13
3F：→ tynse71864: MeOH比例下降会让小分子较易飘走 11/02 22:15
4F：推 tynse71864: 还有你的 Mr只有10 确定4.5没跳海吗？ (虽然我觉得15 11/02 22:20
5F：→ tynse71864: %tricine gel应该是没问题 11/02 22:20
6F：→ Bows: 我们的transfer buffer都没有在 reuse 的，会觉得是degree 11/03 00:51
7F：→ Bows: 的原因其实是有在跑 abeta peptide 在右边下面有很淡的band 11/03 00:51
8F：→ Bows: *degrade 11/03 00:51
9F：推 elelith: 如果要重跑 建议用有2KD的MK monomer dimer 都小於10 11/03 14:53
10F：→ elelith: 就算elisa和IHC有 WB也有可能讯号不够强压不出来 11/03 14:56
11F：→ Bows: 我其实有用 2kDa 的marker 去跑，只是手边图看不清楚，很容 11/03 23:24
12F：→ Bows: 易飘掉 11/03 23:24