作者xxtomnyxx (翼天)
看板Biotech
標題Re: [求救] 如何找轉錄因子
時間Wed Oct 19 12:10:40 2016
※ 引述《QuteMango (芒果是藍波萬)》之銘言：
: 如果我找到一段基因
: 想要利用轉錄因子(TF)增強該基因的表現
如果你只是想增強該基因的表現，
千萬別用這種方法，
因為基本上沒有一個 TF 是只會針對單一基因作用的，
如果直接丟 TF 下去產生的副作用太多，
隨便一個教授都可以電你：
「你怎麼知道你看到的現象是從這個基因來的？
你怎麼知道這不是因為你放的 TF 去影響了其他基因？」
增強一個特定基因表現量的方法，
一般的做法是把那個基因的 ORF clone 到 expression vector 上，
用 vector 上的 promoter 去過量表現它。
: 請問該如何找到那些轉錄因子呢？
: 我目前想到的做法:
: 1.先找到該基因的promoter序列(如何找?)
: 2.找和該promoter相似序列的其他promoter的TF，看是否有可用的
要找到控制一個基因的所有調控單元是很困難的，
雖然部分基因大概 TSS ±5 kb 的序列就有大部分的調控單元，
或是直接找該基因的 CpG island，
可是例外太多了，
調控他的 TF 還有可能座落在數十甚至數百 kb 外的 locus 上，
就算你做 4C 也不一定能找到。
網路上有很多工具可以讓你找 TF，
像是
http://alggen.lsi.upc.es/
這個網站，
它可以幫你分析一段序列有可能會有哪些 TF binding，
可是首先他並沒有包含「所有」的 TF，
只有已知 binding motif 的 TF 能用這個方法，
並且這終究是 predition 而已，
此外一般來說多數 promoter 都會有很多共有的 TF，
像是 Sp1、Tbp 這些不太有 tissue specificity 的 TF ，
如果你背景知識不夠，
很難看出這個 TF 是否就是調控你基因的重要分子。
所以這個分析其實參考價值很低，
以我來說我覺得比較有用的用途是已經知道有某個 TF 會調控，
再用這個分析去找這個 TF 可能的 motif 在哪裡。
此外，
確定是哪些 TF 之後，
還要做 luciferase assay 去驗證，
這整個過程要做的事情非常非常多！
: 應該還有其他更好的方法
: 因為目前在這方面還很外行
: 所以不知道該如何搜索
: 第一次發文，如有錯誤請告知，謝謝。
總而言之，
如果你只是想增強這個基因的表現量，
一般我們都是把基因 clone 出來去過量表現，
而不會用 TF 去增強它的表現。
如果你真的很堅持，
就是要指定在 endogenous 的 gene locus 上下手，
的確是有一種方法可以達到你的需求，
就是 CRISPR/Cas9 的延伸應用：
http://igtrcn.org/over-expressing-insect-genes-using-cas9/
不過這個方法應該所費不貲，
而且也要檢查有沒有 off-target 的影響。
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 120.126.39.94
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1476850249.A.FDA.html
1F：推 cyc5566: 專業推 10/19 15:05
2F：推 blence: 推清楚說明;我猜原po或許不是做常見物種,所以問題不精確 10/19 15:24
對耶！我完全是預設做真核多細胞去回答的...
3F：推 jabari: 專業推 10/19 16:00
※ 編輯: xxtomnyxx (120.126.39.94), 10/19/2016 16:12:15
5F：→ aaaazzzz: 輸入了Snail這段基因(約1700bp)，結果發現有72種轉錄因 10/20 22:23
6F：→ aaaazzzz: 子，從1-1700都有預測的TF，請問要如何知道哪個才是真正 10/20 22:24
7F：→ aaaazzzz: 會調控的因子呢？ 10/20 22:24
正如我前面所說，
用這個分析來找未知的 TF 參考價值很低，
72 種可能還不包含實際上真的會去調控它的。
驗證的方法，
就是把這整段 clone 到 luciferase vector 上，
拿一個會表現 Snail 的 cell line，
把這個 vector 丟到細胞裡看 luciferase 的 activity，
確定這段 promoter 具有轉錄活性後，
在把上面可能的 motif 一個一個 delete 或 mutate 掉，
看看哪些 motif 去掉後 luciferase 的活性會顯著降低，
那麼這些 motif 可能就是調控 Snail 的重要 TF binding 的序列。
然而這是傳統的方法，
以現在研究的進展來看，
這個方法其實只有特定條件下是有用的，
現代的觀點認為基因的轉錄活性與 chromosome 3D 結構有關，
可是你 clone 到 luciferase vector 上的序列未必能完全模擬
endogenous gene locus 的 chromosome 3D 結構。
而且先決條件是你的這段序列真的就是 Snail 的 promoter，
就像我前面說的，
即使你在這 1.7 kb 上找到了重要的 TF site，
也不表示只有這個 TF 會調控 Snail，
可能在距離很遠的 locus 上也還有其他 TF 會調控 Snail。
※ 編輯: xxtomnyxx (120.126.39.94), 10/21/2016 19:41:25
8F：推 aaaazzzz: 非常感謝您詳盡的回答 10/21 23:37
9F：推 QuteMango: 很感謝你的回答! 10/23 16:21
10F：→ QuteMango: 並不是做少見的物種而是小鼠，很抱歉原文中沒有提到 10/23 16:21