作者xxtomnyxx (翼天)
看板Biotech
标题Re: [求救] 如何找转录因子
时间Wed Oct 19 12:10:40 2016
※ 引述《QuteMango (芒果是蓝波万)》之铭言：
: 如果我找到一段基因
: 想要利用转录因子(TF)增强该基因的表现
如果你只是想增强该基因的表现，
千万别用这种方法，
因为基本上没有一个 TF 是只会针对单一基因作用的，
如果直接丢 TF 下去产生的副作用太多，
随便一个教授都可以电你：
「你怎麽知道你看到的现象是从这个基因来的？
你怎麽知道这不是因为你放的 TF 去影响了其他基因？」
增强一个特定基因表现量的方法，
一般的做法是把那个基因的 ORF clone 到 expression vector 上，
用 vector 上的 promoter 去过量表现它。
: 请问该如何找到那些转录因子呢？
: 我目前想到的做法:
: 1.先找到该基因的promoter序列(如何找?)
: 2.找和该promoter相似序列的其他promoter的TF，看是否有可用的
要找到控制一个基因的所有调控单元是很困难的，
虽然部分基因大概 TSS ±5 kb 的序列就有大部分的调控单元，
或是直接找该基因的 CpG island，
可是例外太多了，
调控他的 TF 还有可能座落在数十甚至数百 kb 外的 locus 上，
就算你做 4C 也不一定能找到。
网路上有很多工具可以让你找 TF，
像是
http://alggen.lsi.upc.es/
这个网站，
它可以帮你分析一段序列有可能会有哪些 TF binding，
可是首先他并没有包含「所有」的 TF，
只有已知 binding motif 的 TF 能用这个方法，
并且这终究是 predition 而已，
此外一般来说多数 promoter 都会有很多共有的 TF，
像是 Sp1、Tbp 这些不太有 tissue specificity 的 TF ，
如果你背景知识不够，
很难看出这个 TF 是否就是调控你基因的重要分子。
所以这个分析其实参考价值很低，
以我来说我觉得比较有用的用途是已经知道有某个 TF 会调控，
再用这个分析去找这个 TF 可能的 motif 在哪里。
此外，
确定是哪些 TF 之後，
还要做 luciferase assay 去验证，
这整个过程要做的事情非常非常多！
: 应该还有其他更好的方法
: 因为目前在这方面还很外行
: 所以不知道该如何搜索
: 第一次发文，如有错误请告知，谢谢。
总而言之，
如果你只是想增强这个基因的表现量，
一般我们都是把基因 clone 出来去过量表现，
而不会用 TF 去增强它的表现。
如果你真的很坚持，
就是要指定在 endogenous 的 gene locus 上下手，
的确是有一种方法可以达到你的需求，
就是 CRISPR/Cas9 的延伸应用：
http://igtrcn.org/over-expressing-insect-genes-using-cas9/
不过这个方法应该所费不赀，
而且也要检查有没有 off-target 的影响。
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 120.126.39.94
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1476850249.A.FDA.html
1F：推 cyc5566: 专业推 10/19 15:05
2F：推 blence: 推清楚说明;我猜原po或许不是做常见物种,所以问题不精确 10/19 15:24
对耶！我完全是预设做真核多细胞去回答的...
3F：推 jabari: 专业推 10/19 16:00
※ 编辑: xxtomnyxx (120.126.39.94), 10/19/2016 16:12:15
5F：→ aaaazzzz: 输入了Snail这段基因(约1700bp)，结果发现有72种转录因 10/20 22:23
6F：→ aaaazzzz: 子，从1-1700都有预测的TF，请问要如何知道哪个才是真正 10/20 22:24
7F：→ aaaazzzz: 会调控的因子呢？ 10/20 22:24
正如我前面所说，
用这个分析来找未知的 TF 参考价值很低，
72 种可能还不包含实际上真的会去调控它的。
验证的方法，
就是把这整段 clone 到 luciferase vector 上，
拿一个会表现 Snail 的 cell line，
把这个 vector 丢到细胞里看 luciferase 的 activity，
确定这段 promoter 具有转录活性後，
在把上面可能的 motif 一个一个 delete 或 mutate 掉，
看看哪些 motif 去掉後 luciferase 的活性会显着降低，
那麽这些 motif 可能就是调控 Snail 的重要 TF binding 的序列。
然而这是传统的方法，
以现在研究的进展来看，
这个方法其实只有特定条件下是有用的，
现代的观点认为基因的转录活性与 chromosome 3D 结构有关，
可是你 clone 到 luciferase vector 上的序列未必能完全模拟
endogenous gene locus 的 chromosome 3D 结构。
而且先决条件是你的这段序列真的就是 Snail 的 promoter，
就像我前面说的，
即使你在这 1.7 kb 上找到了重要的 TF site，
也不表示只有这个 TF 会调控 Snail，
可能在距离很远的 locus 上也还有其他 TF 会调控 Snail。
※ 编辑: xxtomnyxx (120.126.39.94), 10/21/2016 19:41:25
8F：推 aaaazzzz: 非常感谢您详尽的回答 10/21 23:37
9F：推 QuteMango: 很感谢你的回答! 10/23 16:21
10F：→ QuteMango: 并不是做少见的物种而是小鼠，很抱歉原文中没有提到 10/23 16:21