作者nellnell (小厚)
看板Biotech
標題[求救] NHEJ assay 原理看不太懂
時間Mon Oct 17 18:34:01 2016
大家好
小弟最近在讀一篇paper 上面有做了NHEJ assay
大概就是說某個基因會加速NHEJ 把那個基因抑制之後發現細胞colony變少
做法是使用兩組細胞 一組control 一組siXXXX (那個基因)
然後另外使用G418去篩選 最後觀察到有G418 也有siXXXX的細胞 colony最少
原文是這樣說 :
Cells were transfected with a linearized vector
harboring a neomycin-resistant gene and an siRNA targeting XXXX (基因)
In the presence of neomycin, only cells that can
integrate the plasmid via NHEJ survive
所以我又去查了他transfect什麼plasmid
結果是這個 : BamHI-XhoI linearized pEGFP-C1
我不懂的是 這個plasmid看起來就是表現GFP 那他要怎麼篩出
只經由NHEJ存活下來的細胞?
不知道有沒有做過這個實驗的學長姊
我看好久還是不太懂
麻煩各位解惑了!!
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1F：→ blence: 你看一下pEGFP-C1的map,應該有標著Neo resistant 10/17 18:40
2F：→ nellnell: 嗯嗯我有看到 但是不懂和NHEJ有什麼關係 10/17 20:03
3F：→ nellnell: 應該說 沒有那個plasmid的細胞會被G418殺死 但是剩下有p 10/17 20:08
4F：→ nellnell: lasmid的細胞為什麼就和NHEJ有關 10/17 20:08
6F：→ xxtomnyxx: "Vector considerations" 裡有寫，linear 的 vector 在 10/18 00:05
7F：→ xxtomnyxx: 細胞中沒辦法維持太久，所以如果細胞沒有靠 NHEJ 把它 10/18 00:06
8F：→ xxtomnyxx: 修補回 circular，這個 vector 就會很快被降解掉。 10/18 00:07
9F：→ xxtomnyxx: 所以用 G418 下去篩活的下來的都是 NHEJ 能力好的細胞 10/18 00:08
10F：→ xxtomnyxx: 得 10/18 00:08
11F：→ blence: 實驗設計B-Xcut應該是為了不想直接接成circular,而且就算 10/18 11:34
12F：→ blence: 是接成circular,naked plasmid也大概只能保留一週就降解掉 10/18 11:38
13F：→ blence: 所以應該不是上面說的 10/18 11:38
14F：→ blence: 這plasmid目的還是genome integration為主;一般要嘛以同源 10/18 11:40
15F：→ blence: 互換,或非同源嵌入(NHEJ),所以G418是要篩出有進到genome 10/18 11:41
16F：→ blence: 的細胞,因為pEGFP沒也設計同源序列,所以推論透過NHEJ機制 10/18 11:43
17F：→ blence: 不過這個不是良好的NEHJ assay 10/18 11:45
18F：→ nellnell: 後來看一些資訊 似乎是有用限制酶去切plasmid 如果NHEJ 10/20 09:04
19F：→ nellnell: 活躍的話會把plasmid重新接上 才不會被G418殺ㄙ 10/20 09:04
20F：→ nellnell: 死 10/20 09:04