作者nellnell (小厚)
看板Biotech
标题[求救] NHEJ assay 原理看不太懂
时间Mon Oct 17 18:34:01 2016
大家好
小弟最近在读一篇paper 上面有做了NHEJ assay
大概就是说某个基因会加速NHEJ 把那个基因抑制之後发现细胞colony变少
做法是使用两组细胞 一组control 一组siXXXX (那个基因)
然後另外使用G418去筛选 最後观察到有G418 也有siXXXX的细胞 colony最少
原文是这样说 :
Cells were transfected with a linearized vector
harboring a neomycin-resistant gene and an siRNA targeting XXXX (基因)
In the presence of neomycin, only cells that can
integrate the plasmid via NHEJ survive
所以我又去查了他transfect什麽plasmid
结果是这个 : BamHI-XhoI linearized pEGFP-C1
我不懂的是 这个plasmid看起来就是表现GFP 那他要怎麽筛出
只经由NHEJ存活下来的细胞?
不知道有没有做过这个实验的学长姊
我看好久还是不太懂
麻烦各位解惑了!!
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1F：→ blence: 你看一下pEGFP-C1的map,应该有标着Neo resistant 10/17 18:40
2F：→ nellnell: 嗯嗯我有看到 但是不懂和NHEJ有什麽关系 10/17 20:03
3F：→ nellnell: 应该说 没有那个plasmid的细胞会被G418杀死 但是剩下有p 10/17 20:08
4F：→ nellnell: lasmid的细胞为什麽就和NHEJ有关 10/17 20:08
6F：→ xxtomnyxx: "Vector considerations" 里有写，linear 的 vector 在 10/18 00:05
7F：→ xxtomnyxx: 细胞中没办法维持太久，所以如果细胞没有靠 NHEJ 把它 10/18 00:06
8F：→ xxtomnyxx: 修补回 circular，这个 vector 就会很快被降解掉。 10/18 00:07
9F：→ xxtomnyxx: 所以用 G418 下去筛活的下来的都是 NHEJ 能力好的细胞 10/18 00:08
10F：→ xxtomnyxx: 得 10/18 00:08
11F：→ blence: 实验设计B-Xcut应该是为了不想直接接成circular,而且就算 10/18 11:34
12F：→ blence: 是接成circular,naked plasmid也大概只能保留一周就降解掉 10/18 11:38
13F：→ blence: 所以应该不是上面说的 10/18 11:38
14F：→ blence: 这plasmid目的还是genome integration为主;一般要嘛以同源 10/18 11:40
15F：→ blence: 互换,或非同源嵌入(NHEJ),所以G418是要筛出有进到genome 10/18 11:41
16F：→ blence: 的细胞,因为pEGFP没也设计同源序列,所以推论透过NHEJ机制 10/18 11:43
17F：→ blence: 不过这个不是良好的NEHJ assay 10/18 11:45
18F：→ nellnell: 後来看一些资讯 似乎是有用限制酶去切plasmid 如果NHEJ 10/20 09:04
19F：→ nellnell: 活跃的话会把plasmid重新接上 才不会被G418杀ㄙ 10/20 09:04
20F：→ nellnell: 死 10/20 09:04